本发明公开一种基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法,所述gp5.5蛋白质来自T7噬菌体基因5.5编码的小蛋白质或来自与所述T7噬菌体gp5.5蛋白质序列同源性高于30%并含有如序列表SEQID NO.1所示特征氨基酸序列,且总氨基酸序列数目在90~110之间的其他噬菌体编码的同源蛋白质;序列表SEQ ID NO.4为携带组氨酸标签及连接肽段的T7噬菌体gp5.5蛋白质氨基酸序列,所述蛋白质保守性较高,与其他噬菌体表达的同源蛋白质序列相似性较高。本发明通过高通量测序首次确证gp5.5蛋白质能结合大肠杆菌细胞内所有种类tRNA,且特异性极高。依赖gp5.5蛋白质分离纯化大肠杆菌总tRNA方法,利用了天然生物大分子相互作用特性,本发明方法快捷方便,无需传统繁琐纯化步骤,得到tRNA纯度显著提高,优势明显。