本发明公开了一锅法生产莱鲍迪苷D的方法,包括如下步骤:构建能分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1,所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;在pH3.5‑7.8的培养基中培养重组菌1,得到培养液;在培养液中加入底物莱鲍迪苷A,加入尿苷二磷酸葡萄糖,硫酸镁或氯化镁,甲醇,反应,得到莱鲍迪苷D。本发明的一锅法生产莱鲍迪苷D在重组菌1发酵生成糖基转移酶UGT1的同时可催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷D,无需纯化UGT1和离心分离就能获得莱鲍迪苷D的。本发明的方法简单、高效、可以降低分离糖基转移酶UGT1的生产成本,可以商业化获得甜度高、口感好、高价值的莱鲍迪苷D。