本发明涉及一种截短的褐藻胶裂解酶基因Aly7B‑CDII，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将该的褐藻胶裂解酶基因Aly7B‑CDII克隆转化到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达该截短体。酶学性质表征结果表明，截短体Aly7B‑CDII对褐藻胶、poly M及poly G均表现出活性。截短体Aly7B‑CDII表现出与全酶相似的底物特异性，但在pH与温度稳定性要优于全酶。本发明对重构发掘新型褐藻胶裂解酶具有极大参考价值，且所获得的褐藻胶裂解酶截短体可作为生产制备褐藻胶寡糖的潜在工具。
本发明公开了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明为了解决现有的褐藻胶裂解酶突变体无法满足工业化生产需求的问题，使用生物信息学软件，通过同源建模、蛋白质表面氨基酸确定、序列比对等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面酸性氨基酸，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶的第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，得到了一种催化活性/效率提高，温度稳定性好，终产物单一性好，利于减少工业化生产中后续产物的纯化成本的褐藻胶裂解酶突变体，为褐藻胶裂解酶突变体进一步工业化应用奠定了基础
本发明属于蛋白质理性设计及酶工程领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7AaM及其应用。本发明以褐藻胶裂解酶Pl7Aa为出发模板，通过结合二硫键和自由能优化两种蛋白质理性设计策略，获得了热稳定性提升的褐藻胶裂解酶突变体Pl7AaM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将本发明获得的褐藻胶裂解酶突变体Pl7AaM在40℃和45℃的水浴处理1小时后，剩余酶活分别是Pl7Aa的2.2倍和8.2倍，具有良好的热稳定性。本发明获得的褐藻胶裂解酶突变体Pl7AaM可用于制备重组载体、重组菌株，以毕赤酵母为重组表达宿主，实现了Pl7AaM的高效表达，用于制备褐藻胶寡糖，进一步为其广泛应用奠定基础。
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种黄杆菌属来源的内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。本发明褐藻胶裂解酶AlgN15来源于黄杆菌属菌株，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述内切褐藻胶裂解酶最适反应温度20℃，稳定性高，常温贮藏6个月，酶活性保持80％以上，对于PolyG具有较高底物偏好性，产物主要聚合度4‑6，占反应产物的60％。本发明将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶AlgN15，可在低温或常温下对海藻粗资源实现高效降解。
本发明提供一种制备富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法，是先使用褐藻胶异构酶来使褐藻胶中甘露糖醛酸M异构化为古洛糖醛酸G；再用氨基酸序列为SEQ ID NO：1的褐藻胶裂解酶来催化制备褐藻四糖。本发明在筛选获得了一种新型的褐藻胶裂解酶的基础上，建立了一种制备发明富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法，所制备的褐藻四糖结构明确，组成稳定；具有在医药等领域应用的前景。
