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[发明专利]一株高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株-CN201710956435.7在审
发明人：张翠英;肖冬光;刘鑫;葛峻伶;郭学武;陈叶福;董建;杜丽平;马丽娟 -专利权人：天津科技大学
申请日： 2017-10-11 - 公布日： 2019-04-19 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明提供了一种高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，包括多拷贝整合载体的构建以及选育菌株的发酵验证。以CALB基因为目的基因，选育的酵母菌株对南极假丝酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B进行多拷贝表达，与亲本菌株相比，所构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株基本发酵性能不受影响，高粱原料半固态白酒发酵6天后，选育菌株乳酸乙酯含量达223.159mg/L，亲本菌株乳酸乙酯量为114.04mg/L，多拷贝菌株相比较亲本菌株提高了92.3％。选育的酿酒酵母菌株显著提高乳酸乙酯生成量，使得白酒酒体更丰富，口感更协调，在白酒相关领域有广泛的应用。
酿酒酵母菌株亲本菌株乳酸乙酯菌株高产乳酸多拷贝构建乙酯白酒发酵南极假丝酵母多拷贝菌株白酒酒体发酵性能高粱原料酵母菌株目的基因酿酒酵母整合载体脂肪酶B 半固态生成量验证应用协调

[发明专利]通过转座的DNA整合-CN96192093.9无效
发明人： S·T·乔根森 -专利权人：诺沃挪第克公司
申请日： 1996-01-23 - 公布日： 1998-03-25 - 主分类号： C12N15/75 文献下载
摘要：革兰氏阳性细菌的多拷贝菌株,含有多拷贝感兴趣的DNA序列,该菌株通过以下方法构建通过转座将含有感兴趣的DNA序列的DNA结构导入受体细胞基因组,然后通过一个解离系统使用于选择具有接收到的DNA结构的细胞的标记基因缺失该多拷贝菌株最好没有编码不需要的标记如抗生素抗性标记的基因。
通过 dna 整合

[发明专利]目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法-CN202010799482.7有效
发明人：温廷益;王来友;邓爱华;商秀玲 -专利权人：中国科学院微生物研究所
申请日： 2018-01-19 - 公布日： 2022-05-03 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。所述目的基因多拷贝整合的方法包括(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。本发明将CRISPR‑Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA重复单元的多拷贝特点相结合首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上整合高达10余个拷贝目的基因的方法。
目的基因拷贝整合方法重组以及血清白蛋白制备

[发明专利]目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法-CN201810054262.4有效
发明人：温廷益;王来友;邓爱华;商秀玲 -专利权人：中国科学院微生物研究所
申请日： 2018-01-19 - 公布日： 2020-09-08 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法。所述目的基因多拷贝整合的方法包括(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。本发明将CRISPR‑Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA重复单元的多拷贝特点相结合首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上整合高达10余个拷贝目的基因的方法。
目的基因拷贝整合方法重组藜芦以及血清白蛋白制备

[发明专利]一种棒杆菌中基因多拷贝整合方法-CN202310699287.0在审
发明人：史锋;陈睿;李永富 -专利权人：江南大学
申请日： 2023-06-14 - 公布日： 2023-09-12 - 主分类号： C12N15/77 文献下载
摘要：本发明公开了一种棒杆菌中基因多拷贝整合方法，具体涉及一种在谷氨酸棒杆菌等棒杆菌中进行基因多拷贝整合的方法，属于基因工程领域。本发明提供的多拷贝整合系统是基于IScg1基因在谷氨酸棒杆菌有8个拷贝，通过不断进行整合质粒的转化及逐步提高的筛选压力将多个目的/外源基因表达框整合在染色体上，最后经过10轮进化，成功构建多拷贝整合目的基因的重组菌株其中，所述筛选标记表达盒包括内源性启动子和筛选标记基因，通过弱启动子降低菌株对抗生素的耐受性，从而提高目的菌株的筛选效率，为谷氨酸棒杆菌基因多拷贝整合提供了新的思路。
一种杆菌基因拷贝整合方法

[发明专利]多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法-CN201910011756.9在审
发明人：梁伟凡;周玉岩;逯佩凤;丁小云 -专利权人：广东海纳川生物科技股份有限公司
申请日： 2019-01-07 - 公布日： 2019-05-31 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明公开一种多拷贝表达载体、表达菌丝霉素的毕赤酵母及其制备方法，所述方法利用rDNA非转录间隔区的基因片段作为整合位点，把菌丝霉素NZ2114表达盒整合至毕赤酵母基因组得到的毕赤酵母菌株菌丝霉素表达量高、菌株稳定性好，解决了现有技术中利用毕赤酵母菌株构建菌丝霉素表达菌株过程繁琐、构建的表达菌株中菌丝霉素拷贝数低、表达量少、筛选工作量大、菌株不稳定的问题。
菌丝毕赤酵母菌株毕赤酵母表达菌株表达载体表达量多拷贝构建整合制备毕赤酵母基因组菌株稳定性基因片段表达盒非转录间隔区拷贝数菌株位点工作量筛选

[发明专利]一种高产菊粉内切酶的双启动子多拷贝重组毕赤酵母菌株-CN201410215648.0无效
发明人：林建强;林胜强;白杨;林建群 -专利权人：山东大学
申请日： 2014-05-21 - 公布日： 2014-08-13 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明公开了一种高产菊粉内切酶INU2的双启动子多拷贝重组毕赤酵母工程菌株，所述菌株命名为毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-A3-G2，已于2014年04月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心本发明的菌株通过两种质粒pPIC9K和pGAPZαA将菊粉内切酶基因INU2多拷贝整合入毕赤酵母GS115基因组上，并从中筛选获得了高效表达菊粉内切酶的双启动子多拷贝酵母基因工程菌株。实验证实，该菌株在3L高密度发酵中菊粉酶酶活性可达3006U/ml，简单纯化的粗酶液即可直接用于水解菊粉产生低聚果糖，转化效率高，使其在工业中用菊粉酶解法生产低聚果糖成为现实，具有巨大的实用价值。
一种高产菊粉内切酶启动子拷贝重组酵母菌株

[发明专利]一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法-CN202011016225.8在审
发明人：杨琥;陈莹;谭华菊 -专利权人：武汉华美生物工程有限公司
申请日： 2020-09-24 - 公布日： 2021-02-12 - 主分类号： C12N9/60 文献下载
摘要：本发明公开了一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，属于生物技术领域。一种蛋白酶K多拷贝菌种构建方法，利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝菌种，具体步骤主要如下：S1、多拷贝载体构建；S2、多拷贝菌种的筛选；S3、多拷贝菌种大规模发酵；本发明利用Biobrick的方法人工体外构建蛋白酶K多拷贝串联表达盒；这种构建方法的优势在于重组质粒的拷贝数是可控的，不需要依赖于对高浓度抗性药物的筛选，也不需要进行大规模的筛选，基因剂量效应被认为是毕赤酵母表达外源蛋白的最重要的因素，多拷贝菌株的表达量比单拷贝高出很多倍，从而提高了蛋白酶K的产量，价格更低廉，使之可以被运用到各个领域。
一种蛋白酶拷贝菌种构建方法

[发明专利]一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法-CN202011420240.9在审
发明人：洛克珊娜;奥兰多;徐洪利;高祥友 -专利权人：山东元泰生物工程有限公司
申请日： 2020-12-08 - 公布日： 2021-06-25 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明公开了一种乳酸乳酸链球菌素高表达菌株的构建方法，涉及工业领域，将野生型乳酸乳球菌菌株中的nisA和nisRK基因克隆到高拷贝数载体中，将得到的质粒pMG36e:nisA和pMG36e:nisRK通过单重和三重转化导入乳酸乳球本发明通过在乳酸乳球菌中引入含有nisRK的多拷贝质粒来提高Nisin的产量。我们设计了携带nisA和nisRK基因的表达质粒，并将工程质粒转入野生型菌株。Nisin作为一种信号分子，可通过双组分信号转导诱导Nisin生物合成基因簇的转录，该信号转导由一个响应调节因子和一个指定nisRK基因的组氨酸激酶组成；在野生型菌株内转化nisA和nisRK多拷贝基因后
一种乳酸链球菌素表达菌株构建方法

[发明专利]一种亚细胞结构定位的大麻二酚酸合成酶的酿酒酵母菌株构建方法和应用-CN202310852672.4在审
发明人：陈雨彤;谢玉萍;李林;刘成英;胡瑾瑜;罗小舟 -专利权人：森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
申请日： 2023-07-12 - 公布日： 2023-10-17 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明公开了一种亚细胞结构定位的大麻二酚酸合成酶的酿酒酵母菌株构建方法和应用，属于合成生物学技术领域、基因工程领域。本发明以能够合成CBDA的酿酒酵母为出发菌株，将特定亚细胞结构定位蛋白与CBDAS通过linker融合表达，从中筛选得到有效提高CBDA产量的亚细胞结构定位蛋白整合于同一酿酒酵母菌株中，优化了CBDAS进一步的，多拷贝整合表达CBDAS，探究不同定位与单一定位的CBDAS的多拷贝表达对CBDA产量的影响，得到较单拷贝表达CBDA产量提高的重组酿酒酵母，摇瓶培养一定时间，产量达到400μM以上。
一种细胞结构定位大麻二酚酸合成酿酒酵母菌株构建方法应用

[发明专利]基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法-CN202210604030.8在审
发明人：董聪;王玥;高庆华;罗同阳;刘攀;王庆庆 -专利权人：河北省微生物研究所有限公司
申请日： 2022-05-31 - 公布日： 2022-08-12 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明提供了一种筛选高表达FAD‑GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，包括如下步骤：通过同尾酶法构建了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶FAD‑GDH的2‑4拷贝重组表达载体pPICZαA‑2GDH、pPICZαA‑3GDH和pPICZαA‑4GDH；其中在试管水平，单拷贝平均酶活11.953U/mL，二拷贝平均酶活27.99U/mL，三拷贝平均酶活44.792U/mL，四拷贝平均酶活57.027U/mL；分别比单拷贝提高2.34、3.75、4.78倍；选择单拷贝菌株和四拷贝菌株进行10L罐扩大培养，单拷贝菌株诱导108h酶活达到最高697.125U/mL，四拷贝菌株诱导132h酶活达到最高1063.279U/mL，比单拷贝酶活提高本发明表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD‑GDH的表达量。
基于基因拷贝筛选表达 fad gdh 重组酵母菌株方法

[发明专利]利用原位倍增blm基因簇及双报告基因制备博莱霉素高产菌株的方法及其应用-CN202110794075.1有效
发明人：刘钢;李红;高文延 -专利权人：中国科学院微生物研究所
申请日： 2021-07-14 - 公布日： 2023-06-13 - 主分类号： C12Q1/04 文献下载
摘要：本发明公开了利用原位倍增blm基因簇及双报告基因构建博莱霉素高产菌株的方法及其应用。本发明提供了一种制备博莱霉素高产重组菌株的方法，为利用ZouA系统和双报告基因筛选使将轮枝链霉菌中的blm基因簇倍增，得到blm基因簇拷贝数增加的菌株，即为博莱霉素高产重组菌株。本发明从卡那霉素链霉菌中克隆了ZouA系统的组成元件，并在博莱霉素的原始生产菌株‑轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)ATCC15003中构建了ZouA系统，通过该系统原位倍增了blm基因簇，并开发了aac(3)IV‑xylE双报告基因介导的高通量筛选多拷贝blm基因簇重组菌株的方法，得到高产博莱霉素菌株。
利用原位倍增 blm 基因报告制备霉素高产菌株方法及其应用

[发明专利]用于基因的稳定的染色体多拷贝整合的方法-CN01811587.X有效
发明人：斯蒂恩·T·乔根森;詹斯·T·安德森;迈克尔·D·瑞斯马森;卡斯滕·奥尔森 -专利权人：诺维信公司
申请日： 2001-06-21 - 公布日： 2003-08-20 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明解决的问题是通过同源重组将目的基因的多拷贝整合到充分限定的位点，所述位点相邻与细菌宿主菌株染色体中的条件必需基因，所述染色体中在不同位点已经包含了目的基因的至少一个拷贝。
用于基因稳定染色体拷贝整合方法

[发明专利]含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌DraT^－工程菌株-CN03138429.3无效
发明人：李季伦;陈三凤;张耀平;赵银锁;马旅雁;王娟 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2003-06-02 - 公布日： 2004-12-08 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明提供了一种含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)DraT^－工程菌株，保藏号为：CGMCC No.0876。本发明还提供了一种菌肥，它含有本发明的含多拷贝nifA基因的巴西固氮螺菌DraT^－工程菌株。
拷贝 nifa 基因巴西固氮 drat sup 工程菌株

[发明专利]用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包-CN202210208817.2在审
发明人：周景文;高松;余世琴;曾伟主;陈坚 -专利权人：江南大学
申请日： 2022-03-04 - 公布日： 2022-06-03 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明公开了用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包，属于基因工程和代谢工程领域。通过更换起始密码子降低了TPR1的表达强度，获得了可用于酿酒酵母基因组高拷贝整合的重组质粒。更换TRP1的启动子为AAG或者GUG后的TRR1AAGdeg和TRR1GUGdeg具有良好的高拷贝整合能力，使转化后的菌株的荧光强度显著提升且降低了转化子数量，提升了筛选效率并有助于获得更高拷贝的菌株。
用于酿酒酵母拷贝整合质粒工具包

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