[发明专利]一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201910955182.0 | 申请日： | 2019-10-09 |
| 公开（公告）号： | CN110551749A | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 崔格特 | 申请（专利权）人： | 武汉博欧特生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/78 | 分类号： | C12N15/78;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/40 |
| 代理公司： | 42247 武汉红观专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 张文俊 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法，并提供了该自杀载体在恶臭假单胞菌中进行基因敲除的应用方法。首先将pBBR1MCS‑5质粒的复制子替换成R6K复制子，使得其能在大肠杆菌S17/λpir中复制，而不能在恶臭假单胞菌中复制，然后在该质粒中依次插入待敲除靶基因的上游同源臂、抗生素抗性筛选基因和待敲除靶基因的下游同源臂，从而得到恶臭假单胞菌基因敲除自杀载体。将该自杀载体通过转化或接合转移导入恶臭假单胞菌中，构建待敲除靶基因的缺失突变株。本发明提出的构建恶臭假单胞菌基因缺失突变株的方法，方便快捷，正确率高。 | ||
| 搜索关键词： | 恶臭假单胞菌 自杀载体 靶基因 构建 敲除 基因敲除 复制子 同源臂 质粒 复制 基因缺失突变株 抗生素抗性筛选 大肠杆菌 缺失突变株 接合 正确率 替换 上游 基因 应用 转化 | ||
【主权项】：
1.一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；/nS2、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到R6K复制子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；/nS3、将步骤S1所述DNA片段与步骤S2所述R6K复制子均用限制性内切酶NdeI进行酶切，然后连接得到载体pBR6K；/nS4、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的上游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup；/nS5、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到卡那霉素抗性基因，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan；/nS6、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的下游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan-down。/n
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