[发明专利]一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法，并提供了该自杀载体在恶臭假单胞菌中进行基因敲除的应用方法。首先将pBBR1MCS‑5质粒的复制子替换成R6K复制子，使得其能在大肠杆菌S17/λpir中复制，而不能在恶臭假单胞菌中复制，然后在该质粒中依次插入待敲除靶基因的上游同源臂、抗生素抗性筛选基因和待敲除靶基因的下游同源臂，从而得到恶臭假单胞菌基因敲除自杀载体。将该自杀载体通过转化或接合转移导入恶臭假单胞菌中，构建待敲除靶基因的缺失突变株。本发明提出的构建恶臭假单胞菌基因缺失突变株的方法，方便快捷，正确率高。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法及其应用。

背景技术

恶臭假单胞菌是一类革兰氏阴性菌，具有广泛的代谢多样性和对不同环境的强适应性，经常被用于细菌基础代谢途径的研究，还被广泛地应用于各种生物技术应用中，如污染物的生物修复和特殊化学合成物的生产等。基因敲除是菌株遗传操作的主要方式，也是进行基因和蛋白功能研究、阐述生物降解途径和调控的主要方法，因此发展高效、快捷、准确的基因敲除手段是充分利用恶臭假单胞菌的重要前提。

自杀质粒是指一些在某些特定细菌中自主复制而在其它细菌中不能自主复制的质粒，由于大多数细菌中不存在复制基因起始所需的复制蛋白而无法复制，因此，当自杀质粒进入宿主细胞时，要么不能复制，被消除，要么在外界选择性压力的作用下整合到宿主染色体上，和染色体一起复制。依据自杀质粒的这一特点，将采用基因工程技术构建的基因突变DNA片段克隆入自杀质粒，利用突变基因两端的同源片段与基因组发生同源交换，构建得到精确的基因缺失突变株，而质粒本身由于自杀性特性连同染色体上原有的野生型基因一起随着细菌的传代从菌体中消失。

目前应用广泛的恶臭假单胞菌基因敲除载体为pK18mobsacB，这种传统自杀载体进行基因敲除时存在一些明显缺陷，包括：(1)sacB是被广泛用作自杀载体的致死基因，但sacB所引发的蔗糖致死效应在恶臭假单胞菌中教弱，导致筛选到正确缺失突变株的比例非常低，造成筛选工作量增大；(2)自杀载体本身较大，造成质粒接合转移的效率低；(3)同源臂连接到一起，进行二轮筛选，但由于第二轮交换回复为野生型的概率非常大，正确率低，常用手段为PCR验证，增加了筛选敲除突变体的成本。因此，当用于恶臭假单胞菌基因敲除时，现有自杀载体表现出明显的局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法及其应用，实现高效、快捷、准确地对恶臭假单胞菌进行基因敲除。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提出了一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法，包括如下步骤：

S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

S2、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到R6K复制子，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

S3、将步骤S1所述DNA片段与步骤S2所述R6K复制子均用限制性内切酶NdeI进行酶切，然后连接得到载体pBR6K；

S4、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的上游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup；

S5、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到卡那霉素抗性基因，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan；

S6、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的下游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan-down；