[发明专利]评价缩水甘油及其酯体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用

摘要

本发明公开了一种评价缩水甘油及其酯体内暴露的血红蛋白加合物检测方法，包括制备血红蛋白干粉，将血红蛋白粉进行衍生及净化；设定色谱条件进行等度洗脱；设定质谱条件进行质谱定量检测；利用上述液相‑质谱联用方法，通过标准曲线法对样品进行定量分析。本发明采用了同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC‑MS/MS)，对缩水甘油的血红蛋白加合物进行定量，分析时间大大缩短，同时使得Gly‑Val‑PTH空间异构体得到较好的分离，实现同步检测，这能够更加全面的对缩水甘油的内暴露量进行评估。

主权项

1.评价缩水甘油及其酯体内暴露的血红蛋白加合物检测方法，包括步骤1)的制备血红蛋白干粉，其特征是还包括以下步骤：2)、衍生及净化：取20～100mg的血红蛋白粉加入0.8～3mL的甲酰胺和20～100μL的1mol/L NaOH溶液，再加入5～30μL的衍生剂‑‑‑‑五氟苯基硫代异氰酸酯，涡旋混匀；在室温下震荡12～24h进行衍生化，然后在30～60℃水浴继续衍生0.5～6h；水浴衍生结束后，再加入0.2～2mL的20％NaCl溶液以及20μL同位素内标‑‑‑d5‑Gly‑Val‑PTH溶液，涡旋混合均匀，在转速8000～12000rpm下离心2～15min，取上清液；将固相萃取柱活化、平衡后，取上清液上样，先用2～3mL淋洗液淋洗，然后2～3mL甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液在40℃下氮气吹干，用流动相定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；所述淋洗液为体积浓度5％～10％甲醇水溶液；所述流动相为流动相A：流动相B：＝40:60～60:40的体积比；3)、色谱条件：仪器：超高效液相色谱；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；流动相A：0～1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈；等度洗脱比例：A :B＝40:60～60:40；进样体积：5～10μL；进样时间：10～15min；所述色谱柱种类及规格为ACQUTITY HSS T3或ACQUTITY BEH C18；4)、质谱条件：仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测(MRM)；离子源：电喷雾(ESI)负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；毛细管电压：2000～3000V；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气；表1、Gly‑Val‑PTH及其同位素的质谱参数注：^a为定量离子通道，^b为定性离子通道；5)、结果：利用上述液相‑质谱联用方法，通过标准曲线法对样品进行定量分析。