[发明专利]评价缩水甘油及其酯体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用

权利要求书

1.评价缩水甘油及其酯体内暴露的血红蛋白加合物检测方法，包括步骤1)的制备血红蛋白干粉，其特征是还包括以下步骤：

2)、衍生及净化：

取20～100mg的血红蛋白粉加入0.8～3mL的甲酰胺和20～100μL的1mol/L NaOH溶液，再加入5～30μL的衍生剂----五氟苯基硫代异氰酸酯，涡旋混匀；在室温下震荡12～24h进行衍生化，然后在30～60℃水浴继续衍生0.5～6h；

水浴衍生结束后，再加入0.2～2mL的20％NaCl溶液以及20μL同位素内标---d5-Gly-Val-PTH溶液，涡旋混合均匀，在转速8000～12000rpm下离心2～15min，取上清液；

将固相萃取柱活化、平衡后，取上清液上样，先用2～3mL淋洗液淋洗，然后2～3mL甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液在40℃下氮气吹干，用流动相定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；

所述淋洗液为体积浓度5％～10％甲醇水溶液；

所述流动相为流动相A：流动相B：＝40:60～60:40的体积比；

3)、色谱条件：

仪器：超高效液相色谱；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；流动相A：0～1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈；等度洗脱比例：A:B＝40:60～60:40；进样体积：5～10μL；进样时间：10～15min；

色谱柱为ACQUTITYHSS T3；

4)、质谱条件：

仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测MRM；离子源：电喷雾ESI负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；毛细管电压：2500V；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气；

表1、Gly-Val-PTH及其同位素的质谱参数

注：^a为定量离子通道，^b为定性离子通道；

5)、结果：

利用上述液相-质谱联用方法，通过标准曲线法对样品进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的评价缩水甘油及其酯体内暴露的血红蛋白加合物检测方法，其特征是：所述步骤2)中的同位素内标，

当为人血样品时，同位素内标d5-Gly-Val-PTH的浓度均1μg/mL；

当为鼠血样品时，同位素内标d5-Gly-Val-PTH的浓度为10μg/mL。