[发明专利]LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用在审
| 申请号： | 201910207151.7 | 申请日： | 2019-03-19 |
| 公开（公告）号： | CN110016482A | 公开（公告）日： | 2019-07-16 |
| 发明（设计）人： | 凃欣;周颖超;谢强 | 申请（专利权）人： | 华中科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/861 | 分类号： | C12N15/861;C12N5/10;A61K35/407;A61P3/06 |
| 代理公司： | 华中科技大学专利中心 42201 | 代理人： | 孙杨柳;曹葆青 |
| 地址： | 430074 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本发明公开了一种LDLR突变体的外泌体及制备方法与制备高脂血症药物的应用，涉及治疗血脂异常药物技术领域。制备方法为将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染肝细胞；突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；转染后，更换无血清培养基继续培养，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；再进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。本发明所述外泌体为内源细胞产生的天然载体，以外泌体作为转运载体，具有免疫源性低、运输效率高、稳定性好和靶向性强以及能跨越血脑屏障等独特优势。 | ||
| 搜索关键词： | 突变体 制备 低密度脂蛋白受体基因 上清液 高脂血症药物 肝细胞 转染 无血清培养基 药物技术领域 单碱基突变 独特优势 分离纯化 免疫源性 内源细胞 胎牛血清 糖链结构 天然载体 血脑屏障 血脂异常 运输效率 转运载体 培养基 靶向性 活细胞 腺病毒 氧连接 去除 接种 突变 应用 漂浮 细胞 治疗 | ||
【主权项】：
1.一种过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：(1)将肝细胞接种在含有胎牛血清的培养基中培养，将过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的腺病毒转染所述肝细胞；所述突变体为低密度脂蛋白受体基因氧连接糖链结构域单碱基突变导致的终止突变；(2)待步骤(1)所述转染6h‑8h后，更换无血清培养基继续培养48h‑72h，再收集上清液；将所述上清液进行离心，去除漂浮活细胞，即得到含有外泌体的上清液；(3)将步骤(2)得到的含有外泌体的上清液进行分离纯化，得到过表达低密度脂蛋白受体基因突变体的细胞外泌体。
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- 2018-12-18 - 2019-04-02 - C12N15/861
- 本发明公开了一种牛mir‑145基因过表达重组腺病毒载体构建方法，以含有牛mir‑145基因序列质粒做模板，设计引物并克隆牛mir‑145基因；经测序验证后重组到表达载体pSB50上，转化进入感受态细胞，获得表达质粒pSB50‑bta‑mir‑145；经AdMax腺病毒系统包装成重组腺病毒载体pAd‑bta‑mir‑145，其滴度为7.27×1010(PFU/ml)；将重组腺病毒载体加入到HEK293细胞，进行扩增、纯化；用高浓度的重组腺病毒载体pAd‑bta‑mir‑145感染牛前体脂肪细胞，实时荧光定量PCR检测牛mir‑145的表达量。其表达水平比对照组高68倍。
- 一种用于免疫治疗的腺病毒载体-201811553060.0
- 李伟;赵桂兰 - 李伟
- 2018-12-18 - 2019-04-02 - C12N15/861
- 本发明公开了一种用于免疫治疗的腺病毒载体，涉及基因工程技术领域，是将干扰片段序列通过基因工程技术，包装到Ad5复制缺陷型腺病毒中，构建重组腺病毒干扰载体Ad‑siDHCR24，所述Ad5复制的缺陷型腺病毒是AD293细胞，通过腺病毒外壳纤维的改造。该用于免疫治疗的腺病毒载体，在哺乳动物中产生HPV蛋白并且诱导针对HPV的免疫应答，通过在腺病毒载体中添加外源重组基因、向导标记以及酶切识别位点，从而改变了腺病毒载体的天然嗜性，使得腺病毒载体的导向更具针对性，避免腺病毒载体感染其他正常组织，使得腺病毒载体所展现的整体的毒副作用更小，从而使得腺病毒载体在免疫治疗中有着更好的效果。
- 一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法-201811325558.1
- 靖超 - 武汉纤然生物科技有限公司
- 2018-11-08 - 2019-03-29 - C12N15/861
- 本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，通过先对动物胶质瘤肿瘤细胞的冻存细胞进行单克隆培养，然后选用CRISPR‑Cas9基因技术，针对于MDR1设计各自的sgRNA，并将其插入至腺病毒中并在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，最后将腺病毒价值胶质瘤肿瘤细胞中，敲除对应的基因片段，从而避免了因这些基因片段损伤突变而使胶质瘤细胞产生耐药性，这种方法基因消除效率高，有助于研究胶质瘤肿瘤耐药的机理，研发更有效的抗肿瘤靶向药。
- 一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法-201610224992.5
- 高贵;光炜 - 高贵;光炜
- 2016-04-12 - 2019-03-15 - C12N15/861
- 本发明公开一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法，其通过选用已商品化的5型重组复制缺陷性腺病毒构建体系(AdEasy)，插入如SEQ ID NO.1所述的双拷贝人p53肿瘤抑制基因真核表达盒，构建p53肿瘤抑制基因重组腺病毒表达载体系统，进一步得到表达双拷贝人p53肿瘤抑制基因的重组复制缺陷型腺病毒颗粒。实验证实其感染肿瘤细胞后，高效表达其携带的p53肿瘤抑制基因。因该病毒整合了双拷贝p53肿瘤抑制基因真核生物基因表达盒，故将大大增加和增快p53肿瘤抑制基因表达量同时可减少病毒用量达到更好的基因治疗效果。特异性强且广谱，直接针对肿瘤细胞的基因突变，可用于各种组织类型的早中晚期恶性肿瘤。
- 携带人miR486基因的重组腺病毒、制备该病毒的载体及应用-201611246243.9
- 袁彪;齐弘炜;张海涛;王立生;孙慧燕 - 首都医科大学附属北京同仁医院;北京知光基因科技有限公司
- 2016-12-29 - 2019-01-29 - C12N15/861
- 本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种携带人miR486基因的腺病毒载体，并提供了所述载体表达的腺病毒的制备和纯化方法，该腺病毒可用于预防或治疗心肌缺血性相关疾病，对心肌梗塞等疾病有很好的疗效。
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