[发明专利]定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物

摘要

本发明公开了定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；2)、用成套引物分别对稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行PCR扩增，再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；计算待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；本发明为一种检测快、成本低、特异性强、灵敏度高、可重复性好的广谱检测硫酸盐还原菌的方法。

主权项

1.一种定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；所述获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的方法包括如下步骤：1)‑a、制备标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液；1)‑b、检测所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数：先检测所述标准品溶液的OD₂₆₀值，再按照如下公式1至公式3计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD₂₆₀值×50(ng/μL)   (公式1)；标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g)   (公式2)；标准品溶液的质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³×标准品的浓度A×10^‑9(g/μL)/标准品的摩尔质量B   (公式3)；1)‑c、按照所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数进行梯度稀释，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；2)、用成套引物分别对所述稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，得到不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数和待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数；再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；再将所述待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数代入标准曲线，计算获得待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；所述成套引物，为能扩增靶序列的引物对；所述靶序列为由引物F和引物R扩增得到的片段；所述引物F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物R为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。