[发明专利]一种γ-氨基丁酸的生物制备方法

摘要

本发明提出了一种γ‑氨基丁酸的生物制备方法，其步骤为1)、用能表达谷氨酸脱羧酶的E.coli工程菌株制备谷氨酸脱羧酶全细胞菌体；2)、用味精和浓盐酸制备L‑谷氨酸；3)、L‑谷氨酸作底物溶于水中，加入谷氨酸脱羧酶全细胞菌体和磷酸吡哆醛，搅拌反应，制备γ‑氨基丁酸。本发明方法以水代替缓冲盐溶液构成水相反应体系，以味精代替高纯度谷氨酸，γ‑氨基丁酸纯度高达97.7％，原料成本降低；用于催化的全细胞可由微生物发酵大规模生产，成本低，来源广；生物酶促催化反应为水相反应，酶法转化条件温和，原料转化彻底，后处理简单，采取蒸发浓缩与自然析晶的方法分离产物，成本低、工艺环保，适于产业化生产γ‑氨基丁酸。

主权项

1.一种γ‑氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于步骤为：1)Gad‑pET28a载体的构建根据GenBank提供的大肠杆菌K‑12的Gad基因序列设计引物F、R，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增Gad基因，凝胶电泳条带约为2000bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；将PCR产物进行纯化，连接到pET28a载体上，得到重组质粒Gad‑pET28a，菌落PCR验证后送测序，测序结果表明谷氨酸脱羧酶基因成功插入至载体pET28a；所述引物F序列(5’‑3’)为atgcaccatcatcatcatcatatggataagaagcaagtaacgga；所述引物R序列(5’‑3’)为ctcgagaattgtgagcgctttagtgatcgctgagatatttcaggga；2)、制备谷氨酸脱羧酶全细胞将1)中构建的重组质粒Gad‑Pet28a转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到能表达谷氨酸脱羧酶的Gad‑Pet28a大肠杆菌工程菌株。将工程菌株接种到含有50mg/L的卡那霉素的SOB液体培养基中，接种比例为10％，接种后于37℃、200rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD₆₀₀达到0.6时，转接至含有2L SOB培养基的5L发酵罐中继续培养，反应前期发酵温度为37℃，后期产酶温度为25℃，搅拌转速为400rpm，通气比及罐压分别为2VVM(立方米/(立方米*分钟))和0.05MPa；发酵过程中每1小时取样监测菌体量并测定酶活力，待菌体量、酶活力均保持稳定时停止发酵，在温度4℃、转速6000rpm、时间5min条件下，离心收集谷氨酸脱羧酶全细胞，备用；3)、用味精制备L‑谷氨酸将10～30g味精溶解于50～8mL水中，加入10～20mL浓盐酸，使味精转变成L‑谷氨酸，并从水中析出并过滤，将过滤得到的L‑谷氨酸用水多次冲洗，至洗下的液体pH大于3时停止冲洗，收集L‑谷氨酸，干燥后备用；4)、制备γ‑氨基丁酸在1L的反应釜中加入500mL水，加入谷氨酸脱羧酶全细胞10～70g/L，加入终浓度0.1～1mM的磷酸吡哆醛，分三次加入L‑谷氨酸100～800g/L；第一次加入1/3的L‑谷氨酸，在35～40℃、220rpm的条件下反应7小时，用薄层层析检测反应的终点进展，转化率超过98％，停止反应；当底物反应完后再补加1/3的L‑谷氨酸，依次重复完成，再加入剩余的L‑谷氨酸，完全反应后，离心收集上清液；5)、γ‑氨基丁酸结晶纯化将步骤3离心收集的上清液80℃加热40min后，离心分离变性蛋白；再80℃蒸发分离后的上清液，待浓缩液体积为原体积的三分之一时，转盛在干净无水的容器中，放置室温，缓慢降温，再置于4℃结晶10～15小时，然后抽滤干燥得到γ‑氨基丁酸晶体。