[发明专利]冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法

摘要

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法，该克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR‑Cas9打靶载体PX330‑pAPN2和PX330‑pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330‑pAPN2或打靶载体PX330‑pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，获得pAPN基因编辑细胞系；(3)对pAPN基因编辑细胞系进行体细胞核移植操作，并将重构胚胎移植入代孕受体，通过自然妊娠出生所述克隆猪。本发明可获得猪冠状病毒受体pAPN完全缺失表达的克隆猪，具有抵抗猪冠状病毒感染的能力。

主权项

1.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，所述CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法为：将PX330载体用限制性内切酶BbsI进行酶切；分别合成第2外显子和第3外显子的gRNA正链和互补链DNA，并在两端带上与酶切后的PX330载体形成的黏性末端相匹配的序列；将第2外显子和第3外显子的gRNA正链与其互补链DNA分别混合，然后将混合后的混合序列置于温度至少为98‑100℃的水中煮沸2.5‑3.5min，然后静置冷却至20‑30℃，使得两条互补链DNA退火形成双链DNA，并携带可与由BbsI酶切后的PX330载体相连接的黏性末端；退火形成的双链DNA与由BbsI酶切后的PX330载体连接；获得打靶载体PX330‑pAPN2和打靶载体PX330‑pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330‑pAPN2或打靶载体PX330‑pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，经单克隆化及筛选获得双等位pAPN敲除的阳性克隆；(3)以阳性细胞为核供体，植入去核猪卵母细胞中，获得阳性重构猪胚胎；再将重构猪胚胎植入代孕母猪子宫内妊娠，获得所述克隆猪。