[发明专利]冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法

说明书

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法，该克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑2所示；制备获得对应gRNA序列的CRISPR‑Cas9打靶载体PX330‑pAPN2和PX330‑pAPN3；(2)将获得的打靶载体PX330‑pAPN2或打靶载体PX330‑pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，获得pAPN基因编辑细胞系；(3)对pAPN基因编辑细胞系进行体细胞核移植操作，并将重构胚胎移植入代孕受体，通过自然妊娠出生所述克隆猪。本发明可获得猪冠状病毒受体pAPN完全缺失表达的克隆猪，具有抵抗猪冠状病毒感染的能力。

技术领域

本发明涉及基因技术，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法。

背景技术

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR-associated protein(Cas)9系统是原核生物的一种适应性免疫系统，用来抵御噬菌体及外源遗传物质侵入。近年来，研究者通过改造该系统使其可适用于哺乳动物的细胞与体内。该系统通过一条与目的DNA位点序列一致的guide RNA(gRNA)进行引导，从而介导Cas9蛋白对目的位点进行特异性地切割，从而形成DNA双链断裂。而基因组上的双链断裂可以显著提升后续的基因敲除(Knockout)和基因敲入(Knockin)的效率，从而可以高效地对目的位点进行修饰操作，从而达到缺失目的基因表达表达，或赋予目的基因以新的功能。CRISPR/Cas9当前已在生物、医学、农业等各个领域都得到了广泛而深入的应用，几乎可以对任何物种的任意基因片段进行随心所欲的编辑。

冠状病毒(Coronavirus)是一类影响养猪业的重要病毒，主要引起猪腹泻和呼吸系统疾病，尤其对仔猪具有较高致死率。当前主要流行的猪冠状病毒包括流行性肠胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratorycoronavirus，PRCV)和丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)等。这其中尤以PEDV最为严重，其近年来广泛流行、常态爆发，对哺乳期仔猪的致死率可达95％以上，给养猪业造成重大经济损失。此类病毒的疫苗防控较为困难，对仔猪的被动乳汁免疫是主要途径，其防控效果尚不够明确；且毒株变异的加快也造成疫苗防控的滞后与无效。

前期的研究发现猪氨肽酶N(Pig Aminopeptidase N，pAPN)是多种冠状病毒的细胞受体，包括TGEV、PRCV、PDCoV等，PEDV感染宿主的受体也可能为pAPN，但尚存在争议。细胞水平的研究发现冠状病毒非敏感细胞导入表达pAPN后可以变为冠状病毒的敏感细胞；而阻断冠状病毒与pAPN的结合可以抑制其对宿主细胞的感染。因此如能缺失猪体内pAPN基因的表达，将会阻断多种冠状病毒对猪的感染。培育该种受体缺失猪对养猪业具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪，通过将猪冠状病毒受体pAPN基因敲除，完全缺失猪体内pAPN蛋白的表达，从而具有抵抗猪冠状病毒感染的能力；

基于上述，本发明还提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，利用CRISPR/Cas9系统介导的定点打靶技术对pAPN基因进行移码突变，从而获得pAPN基因敲除的克隆猪。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，包括以下步骤：