[发明专利]一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，包括提取覆盆子及其多种混淆品DNA、选取PCR扩增引物核苷酸序列、PCR扩增、PCR扩增产物质量检查，用限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应后进行琼脂糖凝胶电泳分析，即可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品。其优点为准确性高，稳定性好，通用性高，成本低，步骤简单快速，受药材DNA模板质量及反应条件等影响小。

主权项

1.一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’‑CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG‑3’和下游引物核苷酸序列5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物，模板DNA和双蒸水混匀，而后在90～95℃预变性2～5分钟后变性20～40秒，53～55℃退火20～40秒，70～75℃延伸20～40秒，20～30个循环，最后70～75℃延伸3～5分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为650～800bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA‑trnH、rpoC1、rpoB、psbK‑psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为30～40℃，反应时间为15～20分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为110～130V下，电泳35～45分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现165～175bp+530～560bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有二条带或条带分子量，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品；此后，鉴别覆盆子及其多种混淆品只需重复步骤一、二、四、五。