[发明专利]一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法

权利要求书

1.一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA，其中混淆品包括周毛悬钩子、木莓、寒莓、蓬蘽、茅莓、高粱泡、太平莓、树莓、插田泡；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物，模板DNA和双蒸水混匀，而后在95℃预变性5分钟后变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，28个循环，最后72℃延伸3分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为700～750bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为37℃，反应时间为15分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为120V下，电泳40分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现171bp+545bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有171bp+545bp二条带，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品；此后，鉴别覆盆子及其多种混淆品只需重复步骤一、二、四、五。

2.如权利要求1所述的一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物质量检查：取DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，在120V电压下电泳，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，在紫外凝胶成像系统下检测DNA条带。

3.如权利要求1所述的一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，所述的10×缓冲液的组成为：10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸，100毫摩尔/升氯化钾，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，0.2毫克/毫升牛血清白蛋白，50％甘油。

4.一种快速鉴别覆盆子及其多种混淆品的方法，其特征在于，包括以下：步骤一：提取覆盆子及其多种混淆品的DNA，其中混淆品包括周毛悬钩子、木莓、寒莓、蓬蘽、茅莓、高粱泡、太平莓、树莓、插田泡；步骤二：PCR扩增：首先选取上游引物核苷酸序列5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’和下游引物核苷酸序列5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；然后在PCR管中制备25微升反应体系：加入10×PCR缓冲液，25毫摩尔/升镁离子，10毫摩尔/升dNTP，5单位/微升Taq酶，20微摩尔/升引物制备预混液， 最后加入模板DNA和双蒸水进行充分混匀，而后在92℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，28个循环，最后72℃延伸3分钟，得到的PCR扩增的基因片段大小为700～750bp，再对反应后的PCR扩增产物进行质量检查；步骤三：用PCR产物进行DNA测序，采用双向测序测定核苷酸序列，先后用不同引物测定覆盆子及其多种混淆品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH、rpoC1、rpoB、psbK-psbI、ITS多个DNA序列，经序列分析，覆盆子样品序列具有限制性内切酶DpnII或MboI的识别位点，识别序列为/gatc；步骤四：在灭菌离心管中加入PCR产物，10×缓冲液，灭菌超纯水，限制性内切酶DpnII或MboI进行酶切反应，反应温度为37℃，反应时间为15分钟；步骤五：取适量的酶切反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，在电压为120V下，电泳40分钟，电泳结束后将凝胶用溴化乙锭染色，若样品出现171bp+545bp二条带，则供试样品为覆盆子，若不具有171bp+545bp二条带，则供试品非覆盆子来源或混杂有其他混淆品，从而可快速鉴别判断药材覆盆子的真伪及是否掺入了混淆品；此后，鉴别覆盆子及其多种混淆品只需重复步骤一、二、四、五。