[发明专利]一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法

摘要

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ALPK2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，+胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉ALPK2基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。

主权项

1.一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼ALPK2基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl‑heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计ALPK2基因的靶位点靶点的选择必须遵循此标准：5’‑GG‑(N)18‑NGG‑3’其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响ALPK2基因的整个结构域，从而来改变基因的表达两对特异性靶位点PCR引物如下：两对特异性靶位点PCR引物如下：F1(靶位点3正向引物)：tgtaatacgactcactata ggtgactagtcctctttcca gttttagagctagaaatagcR(共用的反向引物)：aagcaccgactcggtgccactF2(靶位点4正向引物)tgtaatacgactcactata ggtttggctctccattgttg gttttagagctagaaatagcR(共用的反向引物)：aagcaccgactcggtgccactPCR检测引物上下游引物分别位于2号内含子以及3号内含子上：F(5’‑gaggactgggagctaacat‑3’)R(5’‑cagacttccgtgtagtttggc‑3’)2)构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1‑2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：混匀后于37℃水浴，酶切2.5h以上c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架；反向引物R：20bp sgRNA下游骨架PCR反应体系(50μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s)30个循环，再72℃8min待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.6％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物e,测定纯化的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase‑Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入0.2mL RNase‑Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2.5h；水浴结束后，向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1μL样品，用配制好的1.6％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；f，特异性gRNA的纯化用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于‑20℃吸取纯化后的gRNA溶液1μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度3)斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中在进行显微注射之前，将Cas9蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9蛋白的终浓度为5μg/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL注射约3μL Cas9蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析显微注射体系如下：4)Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其ALPK2基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范a、提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精48小时后(48hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10颗胚胎)，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃恒温箱中裂解过夜裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积(200μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000rpm离心10min，倒掉上清液；加入70％乙醇500μL，于4℃条件下，12000rpm离心5min，弃上清液，室温风干5‑10min；加入20μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率b、PCR扩增目的序列提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约50‑100bp的基因组区域，利用Primer 3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段[0019]PCR反应体系(20μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s)30个循环，再72℃8min待反应结束后，离心PCR产物，取2μL样品点样于1.6％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确c、若PCR产物正确，则用1.6％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，送部分PCR产物进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息4)注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤5)PCR产物的Sanger测序将跑胶结果有两条带的PCR产物送往测序，将测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比；6)获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定将每管胚胎提取基因组，然后PCR扩增出497bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条500bp左右的小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于497bp的小带。