[发明专利]一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法

说明书

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ALPK2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，+胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉ALPK2基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法。

背景技术

ALPK2（alpha-kinase 2）基因位于斑马鱼第11号染色体上，包含10个外显子和9个内含子，cDNA全长5234bp，编码1037个氨基酸。

斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且ALPK2基因进化上较为保守，研究发现ALPK2在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ALPK2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA（终浓度20 ng/μL）和Cas9蛋白（终浓度5 μg/μL），显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC) 和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。

发明内容

本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出ALPK2基因缺失型斑马鱼。

解决上述技术问题的技术方案如下：

1）设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物

在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼ALPK2基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计ALPK2基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响ALPK2基因的整个结构域，从而来改变基因的表达。

两对特异性靶位点PCR 引物如下：

两对特异性靶位点PCR 引物如下：