[发明专利]基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法在审
| 申请号： | 201811620283.4 | 申请日： | 2018-12-28 |
| 公开（公告）号： | CN109652458A | 公开（公告）日： | 2019-04-19 |
| 发明（设计）人： | 郑敦武;段伟婷;程冬洋 | 申请（专利权）人： | 郑敦武;太仓超云生物信息咨询服务有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 | 代理人： | 范晴 |
| 地址： | 215400 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了基于piggyBAC‑Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：将Cas9/gRNA表达元件片段及抗性筛选片段构建在一个载体表达；将上述载体和piggyBAC表达质粒共电转染到目标细胞中，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，挑单克隆进行培养；选前述的单克隆培养细胞进行PCR扩增，确认实际基因组序列；最后切除Cas9/gRNA表达元件。本发明的构件方法应用piggyBAC转作系统，在整合后还可以进行移除，实现无痕基因敲除。 | ||
| 搜索关键词： | 基因敲除 系统构建 细胞株 转染 单克隆培养 基因组序列 培养基筛选 细胞 表达质粒 抗性筛选 目标细胞 片段构建 载体表达 抗性 共电 无痕 移除 整合 切除 | ||
【主权项】：
1.基于piggyBAC‑Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：(1)载体构建:将Cas9/gRNA表达元件片段及抗性筛选片段构建在一个载体表达；(2)质粒电转染和单克隆将上述载体和piggyBAC表达质粒共电转染到目标细胞中，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，pBase表达后将ITR之间序列转座插入基因组，Cas9和gRNA持续表达，进行基因组编辑，挑单克隆进行培养；(3)阳性克隆鉴定选前述的单克隆培养细胞进行PCR扩增，以鉴定目标基因是否敲除成功，对阳性克隆进行测序验证，确认实际基因组序列；(4)切除Cas9/gRNA表达元件将pBase‑MU质粒电转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间的序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。
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