[发明专利]慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法及引物在审
| 申请号： | 201811557035.X | 申请日： | 2018-12-19 |
| 公开（公告）号： | CN109554447A | 公开（公告）日： | 2019-04-02 |
| 发明（设计）人： | 张同存;顾潮江;高阳 | 申请（专利权）人： | 武汉波睿达生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京汇泽知识产权代理有限公司 11228 | 代理人： | 张涛 |
| 地址： | 430074 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路38*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种慢病毒载体在CAR‑T细胞中的整合位点分析方法及应用于该方法的引物序列。所述方法是使用慢病毒载体的LTR区特异引物做单向PCR来捕获插入到基因组上的LTR区，接着用两套接头引物作巢式PCR扩增得到整合位点序列。本发明的方法不依赖于限制性内切酶，而且灵敏度高、特异性和稳定性好，可用于复杂或微量样本中慢病毒载体整合位点的克隆，尤其是临床样本及临床前模型样本。通过PCR的手段捕获得到整合位点序列后，再用生物信息学方法对捕获的整合位点在基因组上进行定位分析，即可对慢病毒载体在宿主细胞的基因组中发生的整合进行安全性评价。 | ||
| 搜索关键词： | 慢病毒载体 整合 位点 基因组 捕获 整合位点序列 限制性内切酶 巢式PCR扩增 安全性评价 生物信息学 接头引物 临床样本 模型样本 宿主细胞 特异引物 微量样本 引物序列 单向PCR 分析 灵敏度 可用 两套 引物 克隆 细胞 应用 | ||
【主权项】：
1.慢病毒载体在CAR‑T细胞中的整合位点分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据慢病毒载体5’LTR区设计特异性扩增引物LTRI，LTRI的5’端用生物素标记；以CAR‑T基因组DNA为模板，作单向线性PCR扩增，用链霉素磁珠收集扩增产物；(2)设计一条5’端磷酸化，3’端双脱氧的单链DNAlinker(ssLC)，用RNA连接酶将单链DNAlinker的5’端与步骤(1)的扩增产物3’端连接；(3)第一轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第一对引物，上游引物LTRII，下游引物LCI，以步骤(2)的连接产物为模板进行PCR扩增；(4)第二轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第二对引物，上游引物LTRIII，下游引物LCII，以步骤(3)的扩增产物为模板进行PCR扩增；(5)步骤(4)的扩增产物进行文库构建，测序分析，即可得出慢病毒载体在CAR‑T细胞中的整合位点。
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