[发明专利]慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法及引物

说明书

本发明公开了一种慢病毒载体在CAR‑T细胞中的整合位点分析方法及应用于该方法的引物序列。所述方法是使用慢病毒载体的LTR区特异引物做单向PCR来捕获插入到基因组上的LTR区，接着用两套接头引物作巢式PCR扩增得到整合位点序列。本发明的方法不依赖于限制性内切酶，而且灵敏度高、特异性和稳定性好，可用于复杂或微量样本中慢病毒载体整合位点的克隆，尤其是临床样本及临床前模型样本。通过PCR的手段捕获得到整合位点序列后，再用生物信息学方法对捕获的整合位点在基因组上进行定位分析，即可对慢病毒载体在宿主细胞的基因组中发生的整合进行安全性评价。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法，以及用于该方法的引物序列。

背景技术

慢病毒(HIV-1，HIV-2)是逆转录病毒中的一类，现有的慢病毒载体来源于多个物种，包括人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)等。它是以慢病毒基因组为基础，去除其表达非必需的基因，代之以治疗基因构建而成的。慢病毒整合到宿主细胞的染色体上可以长期稳定表达，并且与其他逆转录病毒(例如腺病毒)相比，慢病毒不但能感染分裂期细胞，而且还能感染非分裂期的细胞，基于以上优点，慢病毒载体(lentiviral vector)作为外源基因转移载体已广泛用于临床基因治疗。

CAR-T指嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞，是将嵌合抗原受体导入T细胞中，T细胞表达抗体单链的可变区(scFv)并联合T细胞信号区，即能够调控T细胞的功能和特异性，靶向杀伤肿瘤细胞。先将患者自身的T细胞分离出来，加入包装好的慢病毒感染T细胞，慢病毒携带CAR进入T细胞，使T细胞在体外经过嵌合抗原修饰，扩增后，重新输注回患者体内，特异性识别靶抗原从而杀伤靶细胞。

以慢病毒作为载体的明显优点是基因转移效率高，整合率也明显高于其他基因转移方法。然而，由于整合位点是决定外源基因表达水平的因素之一，目前慢病毒载体尚不能将目的基因插入到特定位点而是随机插入，因此慢病毒载体介导的基因转导的可能风险之一是其可能整合到宿主细胞的原癌基因或抑癌基因内引发插入性诱变(insertionalmutagenesis)，导致癌基因的激活或抑癌基因的抑制，从而诱导癌症的发生。这些潜在的副作用已经引起人们的极大关注，所以我们需要对慢病毒载体介导的基因转移的安全性进行评价。

若能明确慢病毒载体在宿主细胞全基因组范围内的整合位点分布规律，则可丰富慢病毒载体在宿主细胞的基因组中整合位点倾向性的认识，并可对其安全性进行评价。

发明内容

本发明的目的在于解决如何更加灵敏、特异、稳定地得到CAR-T细胞中外源片段插入到基因组中的具体位点的问题。

为了实现上述目的，我们通过PCR的手段捕获得到整合位点序列，再用生物信息学方法定位分析。进而提供了一种慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法。

该慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法，包括以下步骤：

(1)根据慢病毒载体5’LTR区设计特异性扩增引物LTRI，LTRI的5’端用生物素标记；以CAR-T基因组DNA为模板，作单向线性PCR扩增，用链霉素磁珠收集扩增产物；

(2)设计一条5’端磷酸化，3’端双脱氧的单链DNAlinker(ssLC)，用RNA连接酶将单链DNAlinker的5’端与步骤(1)的扩增产物3’端连接；

(3)第一轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第一对引物，上游引物LTRII，下游引物LCI，以步骤(2)的连接产物为模板进行PCR扩增；