[发明专利]慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法及引物

权利要求书

1.慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据慢病毒载体5’LTR区设计特异性扩增引物LTRI，LTRI的5’端用生物素标记；以CAR-T基因组DNA为模板，作单向线性PCR扩增，用链霉素磁珠收集扩增产物；

(2)设计一条5’端磷酸化，3’端双脱氧的单链DNAlinker(ssLC)，用RNA连接酶将单链DNAlinker的5’端与步骤(1)的扩增产物3’端连接；

(3)第一轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第一对引物，上游引物LTRII，下游引物LCI，以步骤(2)的连接产物为模板进行PCR扩增；

(4)第二轮PCR扩增：根据DNAlinker序列和慢病毒载体5’端LTR区设计第二对引物，上游引物LTRIII，下游引物LCII，以步骤(3)的扩增产物为模板进行PCR扩增；

(5)步骤(4)的扩增产物进行文库构建，测序分析，即可得出慢病毒载体在CAR-T细胞中的整合位点。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述CAR-T细胞为anti-BCMACAR-T细胞。

3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述单链DNAlinker(ssLC)的核苷酸序列如下：5’-cctaactgctgtgccactgaattcagatctcccgggtc-3’，其5’端进行磷酸化修饰，3’端进行双脱氧修饰。

4.用于权利要求3所述分析方法的引物，其特征在于，核苷酸序列如下所示：

LTRI：5’biotin-aggctcagatctggtctaaccag-3’

LCI：5’-gacccgggagatctgaattcagtg-3’

LTRII：5’biotin-ggctcgccactccccagtcc-3’

LCII：5’-gatctgaattcagtggcacagcagt-3’

LTRIII：5’-tggcctcttctaccttatctgg-3’。