[发明专利]人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法

摘要

本发明涉及人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法，根据四个编码泛素基因的核苷酸差异，分别设计出四个基因的特异引物，提供了能够分析四个不同泛素基因各自的表达量。

主权项

1.人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)引物设计：设计人基因组中四个泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的mRNA表达量的引物以及作为内参基因的GAPDH基因特异性引物；2)细胞总RNA的提取纯化：从培养细胞中提取总RNA，并消化DNA；3)反转录合成cDNA第一链：取1ug总RNA作为模板，反转录合成cDNA第一链；4)荧光定量PCR反应：使用SYBR Green I染料法，分别在每个反应管中加入荧光定量PCR预混合液，相应基因的上游及下游引物，在AnalytikJena qTOWER 2.0荧光定量PCR仪上进行；5)溶解曲线分析：所叙步骤5)中溶解曲线的反应条件：扩增温度以0.5℃的增幅从60℃缓慢递增到95℃，升温的同时连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线；步骤5)溶解曲线分析中，UBB、UBC、UBA52和RPS27A基因均只有一个特异性溶解曲线峰，溶解温度分别为82.67℃、85.35℃、86.93℃和80.25℃，说明所设计的引物具有较好的特异性，可以用于基因表达量分析；步骤5)溶解曲线分析中，GAPDH基因只有一个特异性溶解曲线峰，溶解温度为85.2℃，说明所设计的引物具有较好的特异性，可以用于基因表达量分析；步骤1)所述的人基因组中四个泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的mRNA表达量的引物，是一套用于检测人基因组中四个泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的表达量的引物，保证四个泛素基因的引物都是特异检测该基因的mRNA表达量，不受泛素序列高度保守的影响：UBB基因特异性上游引物的序列：UBB F：5’‑CTGAGGGGTGGCTGTTAATT‑3’，UBB基因特异性下游引物的序列：UBB R：5’‑CATTTTGAACAGGTTCAGCT‑3’；UBC基因特异性上游引物的序列：UBC F：5’‑AAGGCATCCCTCCTGATCAG‑3’，UBC基因特异性下游引物的序列：UBC R：5’‑AGGGGAAACTTAGACACCCC‑3’；UBA52基因特异性上游引物的序列：UBA52 F：5’‑AGGAGGGTATCCCACCTGAC‑3’，UBA52基因特异性下游引物的序列：UBA52 R：5’‑CAATAATGCCACCTCGCAGG‑3’；RPS27A基因特异性上游引物的序列：RPS27A F：5’‑GGAAGATGGACGTACTTTGT‑3’，RPS27A基因特异性下游引物的序列：RPS27A R：5’‑TTCTTGGGAGTGGTGTAAGA‑3’；步骤1)所述的作为内参基因的GAPDH基因特异性引物，是一对用于校正样品之间的上样量差异、个体差异的内参引物，内参基因GAPDH基因特异性上游引物的序列：GAPDH F：5’‑CCTGCACCACCAACTGCTTA‑3’，内参基因GAPDH基因特异性下游引物的序列：GAPDH R：5’‑GGCCATCCACAGTCTTCTGAG‑3’。