[发明专利]人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法

说明书

本发明涉及人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法，根据四个编码泛素基因的核苷酸差异，分别设计出四个基因的特异引物，提供了能够分析四个不同泛素基因各自的表达量。

技术领域

本发明属于生物技术中基因表达的检测技术领域，具体涉及人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法。

背景技术

泛素是一个8.5kDa的小蛋白，在绝大多数的真核生物中都普遍存在。把泛素蛋白通过一些列酶促反应连接标记到其他蛋白的过程称为泛素化(ubiquitination)，被泛素标记的蛋白被称为泛素化蛋白(ubiquitinated proteins)。底物蛋白被泛素标记后，这些泛素化蛋白的主要以下几个命运：被蛋白酶(proteasome)降解；改变在细胞中位置；影响蛋白活性；促进或者干扰蛋白相互作用等。

在人类基因组中有四个基因负责编码泛素蛋白：UBB、UBC、UBA52、RPS27A。哺乳动物基因组中UBB与UBC基因一起同属于中受压力调控的泛素基因。其中，UBB基因编码三个头尾相连的聚泛素前体，在翻译成聚泛素前体之后，会在剪切加工成三个泛素单体，UBB蛋白的功能障碍被发现与神经退化性疾病(如阿兹海默症、匹克氏病)、唐氏综合症、亨廷顿综合症有直接相关性。UBC是另外一个编码聚泛素polyubiquitin-C的基因，编码五个头尾相连的聚泛素前体，是在压力条件下维持泛素水平的重要基因，在免疫系统、DNA修复、激酶活力等方面起着重要的作用。缺失UBC基因会使胞内泛素蛋白水平下降，导致在妊娠中期的胚胎死亡，影响细胞周期的发育，对外界压力的耐受能力降低。UBA52基因是一个在N端编码泛素，C端编码核糖体蛋白L40的融合蛋白。RPS27A基因是一个在N端编码泛素，C端编码核糖体蛋白S27a的融合蛋白。这两个融合蛋白均编码一个泛素，并且融合一个与泛素蛋白酶途径没有关系的蛋白，这类蛋白被广泛认为是伪基因，是基因家族在进化过程中在基因组中形成的无功能的残留物。

泛素途径已被发现与多种疾病和遗传疾病的致病原因有关，机体内的泛素水平的平衡主要由泛素基因来调控，不同的泛素基因在维持泛素水平以及不同的疾病致病机理上起着不同的作用，因此准确评价不同泛素基因的表达对研究泛素途径至关重要。

目前，检测细胞或者组织的泛素表达水平的主要方法在mRNA水平和蛋白水平，具体的操作方法有以下：

1、Northern Blotting：Northern Blotting是目前检测特定RNA表达水平最经典的方法，主要利用放射性标记的DNA探针对目标RNA进行杂交，通过检测与特定RNA结合的放射性探针的放射性信号的强度进行RNA表达量的评估。这个方法主要的难点是RNA容易降解，在电泳和转膜的过程中较容易降解，需较熟练的操作技巧才能得到可信的结果，另外放射性探针在一定程度上对人体有伤害，需要较完善的防护设备方可操作。

2、荧光定量PCR法：目前国内上没有检测泛素基因的专利公开，该方法主要基于对基因的扩增，扩增产物与荧光染料的结合会产生荧光，通过检测荧光的信号强度，计算出目的基因的mRNA表达量。该方法灵敏度高，实验操作相对Northern Blotting简单，目前是进行RNA表达量检测最流行的办法。

3、Western Blotting：又称为蛋白免疫印迹法，主要是利用特异性抗体与目的蛋白相互作用，通过分析特异性抗体的化学发光强度，反应所需要检测的目的蛋白的表达量。该方法是蛋白水平表达检测的最常用方法，能够检测基因翻译成蛋白后的表达水平。在泛素基因表达水平的检测中，Western Blotting检测有个局限性，因为泛素在蛋白质氨基酸层面上是保守的，四个泛素基因所翻译出的泛素蛋白在氨基酸上是完全一致的，通过泛素抗体去检测得到的泛素蛋白表达水平代表的是四个基因所产生的蛋白的总量，而不是每个基因的单独表达水平。