[发明专利]人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法

权利要求书

1.人类四个泛素基因mRNA表达水平荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)引物设计：设计人基因组中四个泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的mRNA表达量的引物以及作为内参基因的GAPDH基因特异性引物；

2)细胞总RNA的提取纯化：从培养细胞中提取总RNA，并消化DNA；

3)反转录合成cDNA第一链：取1ug总RNA作为模板，反转录合成cDNA第一链；

4)荧光定量PCR反应：使用SYBR Green I染料法，分别在每个反应管中加入荧光定量PCR预混合液，相应基因的上游及下游引物，在AnalytikJena qTOWER 2.0荧光定量PCR仪上进行；

5)溶解曲线分析：

所叙步骤5)中溶解曲线的反应条件：扩增温度以0.5℃的增幅从60℃缓慢递增到95℃，升温的同时连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线；

步骤5)溶解曲线分析中，UBB、UBC、UBA52和RPS27A基因均只有一个特异性溶解曲线峰，溶解温度分别为82.67℃、85.35℃、86.93℃和80.25℃，说明所设计的引物具有较好的特异性，可以用于基因表达量分析；

步骤5)溶解曲线分析中，GAPDH基因只有一个特异性溶解曲线峰，溶解温度为85.2℃，说明所设计的引物具有较好的特异性，可以用于基因表达量分析；

步骤1)所述的人基因组中四个泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的mRNA表达量的引物，是一套用于检测人基因组中四个泛素基因UBB、UBC、UBA52、RPS27A的表达量的引物，保证四个泛素基因的引物都是特异检测该基因的mRNA表达量，不受泛素序列高度保守的影响：

UBB基因特异性上游引物的序列：

UBB F：5’-CTGAGGGGTGGCTGTTAATT-3’，

UBB基因特异性下游引物的序列：

UBB R：5’-CATTTTGAACAGGTTCAGCT-3’；

UBC基因特异性上游引物的序列：

UBC F：5’-AAGGCATCCCTCCTGATCAG-3’，

UBC基因特异性下游引物的序列：

UBC R：5’-AGGGGAAACTTAGACACCCC-3’；

UBA52基因特异性上游引物的序列：

UBA52 F：5’-AGGAGGGTATCCCACCTGAC-3’，

UBA52基因特异性下游引物的序列：

UBA52 R：5’-CAATAATGCCACCTCGCAGG-3’；

RPS27A基因特异性上游引物的序列：

RPS27A F：5’-GGAAGATGGACGTACTTTGT-3’，

RPS27A基因特异性下游引物的序列：

RPS27A R：5’-TTCTTGGGAGTGGTGTAAGA-3’；

步骤1)所述的作为内参基因的GAPDH基因特异性引物，是一对用于校正样品之间的上样量差异、个体差异的内参引物，

内参基因GAPDH基因特异性上游引物的序列：

GAPDH F：5’-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’，

内参基因GAPDH基因特异性下游引物的序列：

GAPDH R：5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’。