[发明专利]一种耦合发酵制备海藻糖的方法

摘要

本发明涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法。本发明通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC以及麦芽糖转运蛋白基因EIICB后，构建获得重组工程菌pHT01‑P43‑PhoD‑treS(LM12345)，通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。

主权项

1.一种耦合发酵制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43‑F/P43‑PhoD‑R、PhoD‑P43‑F/PhoD‑TreS‑R进行PCR扩增，分别制得P43基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS‑PhoD‑F/TreS‑R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS片段；通过重叠PCR连接P43基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P43‑PhoD‑treS基因片段；所述引物对的核苷酸序列分别如下：P43‑F：CGCGGATCCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为BamHI酶切位点P43‑PhoD‑R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；PhoD‑P43‑F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG；PhoD‑TreS‑R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；TreS‑PhoD‑F：GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC；TreS‑R：GACGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAAACATGCCCGCTGCTGT；下划线为Aat II酶切位点；(2)将步骤(1)制得的P43‑PhoD‑treS基因片段插入载体pHT01，制得pHT01‑P43‑PhoD‑treS重组载体；(3)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因EIICB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD‑ΔXpf、‑ΔSkfA、‑ΔLytC、‑ΔSdpC、‑ΔEIICB，然后将敲除载体质粒pMAD‑ΔXpf、pMAD‑ΔSkfA、pMAD‑ΔLytC、pMAD‑ΔSdpC、pMAD‑ΔEIICB分别转化B.subtilis WB800n感受态细胞，制得重组菌LM12345；(4)将步骤(2)制得的pHT01‑P43‑PhoD‑treS重组载体转化步骤(3)制得的重组菌LM12345的感受态细胞，制得自诱导分泌型重组菌pHT01‑P43‑PhoD‑treS；(5)将步骤(4)制得的自诱导分泌型重组菌pHT01‑P43‑PhoD‑treS经种子培养、扩大培养后，按3～5％的体积百分比接种至发酵培养基中，在温度35～38℃，转速350～500rpm，发酵培养56～72h，发酵5～8h后，开始流加混合糖液，发酵结束，经纯化，制得含有海藻糖的发酵液。