[发明专利]用于检测奶粉中7种致病菌的7重巢式qPCR引物、试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测奶粉中7种致病菌的7重巢式qPCR引物、试剂盒及检测方法。本发明用生物信息学的方法，根据7种致病菌的保守性基因设计特异性检测外引物，确保引物的特异性，同时进行第一轮7重PCR以提高检测通量，能同时检测7种致病菌；然后根据外引物产物的序列设计内引物，进一步加强方法特异性，同时将第一轮7重PCR产物稀释100倍作为模板，降低了引物二聚体等非特异性引物对第二轮的影响，进而使用荧光定量PCR进行最终检测，以提高检测灵敏度。本发明的引物特异性好、灵敏度高、检测时间短，且本发明检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫也具有指导意义。

主权项

1.一种用于检测奶粉中7种致病菌的7重巢式qPCR引物，其特征在于，包括外引物组和内引物组；其中，外引物组包括坂崎肠杆菌OmpA基因外引物、福氏志贺氏菌RFC基因外引物、大肠埃希菌的uidA基因外引物、单核细胞增生李斯特菌ORF2819基因外引物、金黄色葡萄球菌的NUSC基因外引物、鼠伤寒沙门氏菌的STM4497基因外引物、和蜡样芽孢杆菌的nheA基因外引物；内引物组包括坂崎肠杆菌OmpA基因内引物、福氏志贺氏菌RFC基因内引物、大肠埃希菌的uidA基因内引物、单核细胞增生李斯特菌ORF2819基因内引物、金黄色葡萄球菌的NUSC基因内引物、鼠伤寒沙门氏菌的STM4497基因内引物、和蜡样芽孢杆菌的nheA基因内引物；其核苷酸序列如下所示：OmpA基因外引物的上游引物MCS1：5’‑GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT‑3’；OmpA基因外引物的下游引物MCS2：5’‑GCGCCTCGTTATCATCCAAA‑3’；RFC基因外引物的上游引物TFSG1：5’‑GAGTTCTTTTTTCGTCCC‑3’；RFC基因外引物的下游引物TFSG2：5’‑TCGCAAGCACTATTATGAG‑3’；uidA基因外引物的上游引物UIE1：5’‑AAAACGGCAAGAAAAAGCAG‑3’；uidA基因外引物的下游引物UIE2：5’‑ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG‑3’；ORF2819基因外引物的上游引物OCS1：5’‑CGGTAGAGTAACCATTGAGC‑3’；ORF2819基因外引物的下游引物OCS2：5’‑GCCTCGTTATCATCCAAAA‑3’；NUSC基因外引物的上游引物NUSC1：5’‑CGATTGATGGTGATACGGTT‑3’；NUSC基因外引物的下游引物NUSC2：5’‑GCACTTGCTTCAGGACCAT‑3’；STM4497基因外引物的上游引物MSM1：5’‑TACCGACTTTCACTTCCTGC‑3’；STM4497基因外引物的下游引物MSM2：5’‑CGCACCTCAACATCTTTCAG‑3’；nheA基因外引物的上游引物nheA1：5’‑CTAAGGAGGGGCAAACAGAAG‑3’；nheA基因外引物的下游引物nheA2：5’‑CGTATGCTTGAATAAGCGGTG‑3’；OmpA基因内引物的上游引物2CS1：5’‑CGGTAGAGTAACCATTGAGC‑3’；OmpA基因内引物的下游引物2CS2：5’‑CTTGGGAAAAGTTCACGG‑3’；RFC基因内引物的上游引物3SG1：5’‑TTCTACTTTTTTGGTGTCGG‑3’；RFC基因内引物的下游引物3SG2：5’‑CGCAAGCACTATTATGAGAC‑3’；uidA基因内引物的上游引物1EC1：5’‑GTCCTGTAGAAACCCCAACC‑3’；uidA基因内引物的下游引物1EC2：5’‑ATCCAGACTGAATGCCCAC‑3’；ORF2819基因内引物的上游引物OCS1：5’‑TCCAGGACTTCACTTGTCATTC‑3’；ORF2819基因内引物的下游引物OCS2：5’‑GCAATACTCCAAAAACTCCCTC‑3’；NUSC基因内引物的上游引物1SC1：5’‑CGATTGATGGTGATACGGTTA‑3’；NUSC基因内引物的下游引物1SC2：5’‑TAGGATGCTTTGTTTCAGGTG‑3’；STM4497基因内引物的上游引物1SM1：5’‑GCGGTCAAATAACCCACG‑3’；STM4497基因内引物的下游引物1SM2：5’‑CGCACCTCAACATCTTTCAG‑3’；nheA基因内引物的上游引物1BC1：5’‑GGGCAAACAGAAGTGAAAAC‑3’；nheA基因内引物的下游引物1BC2：5’‑GAATAAGCGGTGATTGTGAT‑3’。