[发明专利]一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和应用

摘要

本发明公开一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和应用，获取灯盏花基因组cDNA经引物克隆得PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FSⅡ基因；酿酒酵母基因组克隆得ADH2、ALD6、ACS、ACCI基因；用Golden gate克隆技术将上述基因及引物扩增的启动子和终止子质粒构建T1至T5重组载体；常规方法将重组载体双向基因扩增片段整合到酿酒酵母基因组常规整合位点内得重组菌株；将F3’H、CPRI基因融合后与穿梭质粒重组并通过同源臂整合到重组菌株染色体内得整合重组菌株；整合重组菌株经营养缺陷型培养基CM‑Trp筛选得产木犀草素的酵母菌株。本发明具有木犀草素得率高、合成方法绿色环保的特点。

主权项

1.一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于包括灯盏花组织DNA提取、酿酒酵母菌基因克隆、重组载体构建、基因重组、可溶性融合蛋白整合、筛选步骤，具体步骤如下：A、灯盏花组织DNA提取：按常规方法获取灯盏花基因组cDNA，将灯盏花基因组cDNA经引物设计克隆得到苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4‑羟基化酶、对香豆酸‑coA连接酶、查尔酮合酶、查尔酮异构酶和类黄酮合成酶Ⅱ的编码基因；B、酿酒酵母菌基因克隆：按常规方法从酿酒酵母基因组中克隆得到乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙酰辅酶A合酶和乙酰辅酶A羧化酶1的编码基因；C、重组载体构建：利用Golden gate克隆技术，分别将A步骤及B步骤得到的基因及由设计好的引物扩增得到的启动子质粒和终止子质粒，共同构建含有基因P1、ALD6、ACS和T1的T1重组载体，基因P2、ADH2、ACCI和T2的T2重组载体，基因P1、PAL、4CL和T3的T3重组载，基因P2、C4H、CHI和T4的T4重组载体，基因P1、CHS、FSⅡ和T5的T5重组载体；D、基因重组：利用常规酵母基因组整合方法将C步骤得到的五个重组载体的双向基因扩增片段整合到酿酒酵母基因组W303的常规整合位点内部，得到产芹菜素的重组菌株；E、可溶性融合蛋白整合：将类黄酮‑3'‑羟化酶、细胞色素还原酶基因经融合后与穿梭质粒YCplac22重组，将重组后的穿梭质粒通过同源臂整合到D步骤得到的重组菌株染色体内，得到整合重组菌株；F、筛选：将E步骤得到的整合重组菌株经过营养缺陷型培养基CM‑Trp筛选，得到产木犀草素的酵母菌株。