[发明专利]一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和应用

说明书

本发明公开一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和应用，获取灯盏花基因组cDNA经引物克隆得PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、FSⅡ基因；酿酒酵母基因组克隆得ADH2、ALD6、ACS、ACCI基因；用Golden gate克隆技术将上述基因及引物扩增的启动子和终止子质粒构建T1至T5重组载体；常规方法将重组载体双向基因扩增片段整合到酿酒酵母基因组常规整合位点内得重组菌株；将F3’H、CPRI基因融合后与穿梭质粒重组并通过同源臂整合到重组菌株染色体内得整合重组菌株；整合重组菌株经营养缺陷型培养基CM‑Trp筛选得产木犀草素的酵母菌株。本发明具有木犀草素得率高、合成方法绿色环保的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种木犀草素得率高、成本低、合成方法绿色环保的通过基因合成改造的产木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和应用。

背景技术

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是真核生物中第一个完成基因组测序的模式生物。酿酒酵母由于具有遗传背景清楚、较高的同源重组效率、能够更好地表达P450酶、良好的生物安全性、在发酵过程中的遗传稳定性等优势，是目前经常使用的平台菌株。

木犀草素（Luteolin）是一种植物应对环境胁迫等产生的黄酮类化合物，因最初是从木犀草（ResedaodorataL.）的叶、茎、枝等组织中分离出而得名。其在自然界中分布较广泛，主要存在于茶叶、金银花、菊花、银杏、紫苏属、黄芩属等众多天然药材中。木犀草素具有的重要药理作用以及多种生物活性，是治疗心血管疾病、肝炎等疾病的良好天然药物，已成为抗菌剂、抗氧化剂、抗肿瘤剂等的处方药，近年来其产量已呈现供不应求的市场需求现状。首先，以木犀草科为代表的草本植物均为一年或多年生，生长周期长，传统种植规模小。其次，化学合成药物对人类的污染和危害极大，出口销往国外尤其欧盟国家对中国产品的溶剂要求做出了严格的限制。因此，生物合成木犀草素以其周期短、成本低、绿色环保的优势已得到越来越多的广泛应用。

木犀草素合成的研究现状：

木犀草素化学式：C₁₅H₁₀O₆；化学名：3',4',5,7-四羟黄酮（3',4',5,7-Tetrahydroxyflavone）。木犀草素（luteolin）是一种代表性的天然类黄酮化合物，具有良好的生理活性，因植物提取方法均存在含量低，提取得率极低，不能满足市场需求的缺点。目前，木犀草素经过几十年来研究人员不断的探索，其一般采用全合成和半合成方法，以期满足市场需要。

a. 全合成途径：早在1980年，卢玉华等首先以间苯三酚为原料，在氯甲基甲醚保护基团对相应醛、酮的酚羟基保护下先合成查尔酮前体，最终制得多羟基黄酮等化合物。该方法时间消耗主要在制备查尔酮反应，该步骤需要经历 6天时间，耗时较长，总收率却只有3~4％，产率较低。经戈夏等于2003年改造全合成路线，总收率达到 22%，时间有所缩短。

b. 半合成途径：1998年，孙志忠等以陈皮提取物橙皮苷为原材料，经采用水解、脱甲基、脱氢三步反应获得了具生理活性的终产物木犀草素，产品总收率约 45%。而彭彬等2009 年采用以芦丁为原料进行微波合成，在300W微波功率下回流1.5h制得纯度为95％的木犀草素，收率高达83.9％，重结晶后得纯度为99.4％产品。然而，这一研究也并非规模化、完整途径生产木犀草素的范例，因此如何实现木犀草素的工业化生产成为人们越来越关注的热点。

发明内容

本发明的第一目的在于提供木犀草素得率高、成本低、合成方法绿色环保的通过基因合成改造的产木犀草素酵母菌株的基因合成方法；本发明的第二目的在于提供一种第一目产生的菌株；本发明第三目的在于提供一种第二目的菌株的应用。

本发明的第一目的是这样实现的：包括灯盏花组织DNA提取、酿酒酵母菌基因克隆、重组载体构建、基因重组、可溶性融合蛋白整合、筛选步骤，具体步骤如下：