[发明专利]一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法及菌株和应用

权利要求书

1.一种产木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于包括灯盏花组织DNA提取、酿酒酵母菌基因克隆、重组载体构建、基因重组、可溶性融合蛋白整合、筛选步骤，具体步骤如下：

A、灯盏花组织DNA提取：按常规方法获取灯盏花基因组cDNA，将灯盏花基因组cDNA经引物设计克隆得到苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟基化酶、对香豆酸-coA连接酶、查尔酮合酶、查尔酮异构酶和类黄酮合成酶Ⅱ的编码基因；

B、酿酒酵母菌基因克隆：按常规方法从酿酒酵母基因组中克隆得到乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙酰辅酶A合酶和乙酰辅酶A羧化酶1的编码基因；

C、重组载体构建：利用Golden gate克隆技术，分别将A步骤及B步骤得到的基因及由设计好的引物扩增得到的启动子质粒和终止子质粒，共同构建含有基因P1、ALD6、ACS和T1的T1重组载体，基因P2、ADH2、ACCI和T2的T2重组载体，基因P1、PAL、4CL和T3的T3重组载，基因P2、C4H、CHI和T4的T4重组载体，基因P1、CHS、FSⅡ和T5的T5重组载体；

D、基因重组：利用常规酵母基因组整合方法将C步骤得到的五个重组载体的双向基因扩增片段整合到酿酒酵母基因组W303的常规整合位点内部，得到产芹菜素的重组菌株；

E、可溶性融合蛋白整合：将类黄酮-3'-羟化酶、细胞色素还原酶基因经融合后与穿梭质粒YCplac22重组，将重组后的穿梭质粒通过同源臂整合到D步骤得到的重组菌株染色体内，得到整合重组菌株；

F、筛选：将E步骤得到的整合重组菌株经过营养缺陷型培养基CM-Trp筛选，得到产木犀草素的酵母菌株。

2.根据权利要求1所述产木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于所述A步骤中的苯丙氨酸解氨酶为PAL，所述肉桂酸4-羟基化酶为C4H，所述对香豆酸-coA连接酶为4CL，所述查尔酮合酶为CHS，所述查尔酮异构酶为CHI，所述类黄酮合成酶Ⅱ为FSⅡ；所述B步骤中的乙醇脱氢酶为ADH2，所述乙醛脱氢酶为ALD6，所述乙酰辅酶 A 合酶为ACS，所述乙酰辅酶A羧化酶1为ACCI；所述E步骤中的类黄酮-3'-羟化酶为F3’H，所述细胞色素还原酶为CPRI。

3.根据权利要求2所述产木犀草素酵母菌株的基因合成方法，其特征在于所述A步骤包括下述分步骤：

A1、向研磨好的粉末状灯盏花组织样品中加入10倍体积的RLT和1倍体积的PLANTaid，室温下迅速搅拌成匀浆后装入离心管剧烈摇晃振荡13～17s，然后经13000rpm离心5～10min，得到上清液；

A2、取上述上清液并加入上清液体积一半的无水乙醇后立即吹打混匀，将混匀的混合物加入基因组清除柱并置于收集管中，经离心至离心管内液体全部滤过且膜上无残留，弃掉滤液；

A3、将上述离心后的基因组清除柱放入离心管内，在基因组清除柱内加入裂解液RLTPlus，然后13000rpm离心30s，得到收集滤液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇并立即吹打混匀，将混匀的混合物加入吸附柱RA并置于收集管中，经离心至离心管内液体全部滤过且膜上无残留，弃掉滤液；

A4、将上述离心后的吸附柱RA加入去蛋白液RW1，室温放置1min，然后经13000rpm离心30s，弃掉废液，再加入漂洗液RW，经13000rpm离心30s，弃掉废液；

A5、将A4得到的吸附柱RA放回空收集管中，经13000rpm离心去除漂洗液，然后将吸附柱RA放入RNAase free离心管中，在吸附膜的中间部位加入RNAase free water并室温放置1min，最后经12000rpm离心1min；

A6、如果预期RNA产量＞30µg，向吸附膜的中间部位加30～50µl的RNase free water并重复分步骤A5，合并两次洗液或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复分步骤A4一遍，得到灯盏花总RNA；

A7、以上述灯盏花总RNA为模板参照RevertAidTM Fist Stand cDNA Synthesis Kit方法反转录合成第一链cDNA，终反应在70℃金属浴保持5min，最后依照DNA纯化试剂盒操作流程进行纯化，得到灯盏花基因组cDNA。