[发明专利]一种改进的启动子及其组成的T载体和应用

摘要

本发明属于基因工程领域，涉及一种改进的启动子及其应用，所述改进的启动子为将启动子区域中的‑35区至‑10区之间的核酸序列突变为核酸内切酶识别位点。本发明能够克服由于采用蓝白筛选的载体存在强启动子启动外源基因的转录或翻译产物可能对宿主有毒性而导致无法克隆的问题，可以避免载体在酶切位点缺失1‑2bp导致基因移码突变产生假阳性克隆的缺陷，可以消除由于外源DNA片段较小并且外源DNA的插入没有改变基因的读码框，造成平板都是蓝斑的假阴性现象。

主权项

1.一种改进的启动子，其特征在于，所述改进的启动子为将启动子区域中的‑35区至‑10区之间的核酸序列突变为核酸内切酶识别位点。

2.根据权利要求1所述的改进的启动子，其特征在于，所述改进的启动子为将β‑半乳糖苷酶的启动子区域中的‑35区至‑10区之间的核酸序列突变为核酸内切酶酶切形成平末端序列的识别位点；

优选地，所述β‑半乳糖苷酶的启动子区域中的‑35区至‑10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示；

优选地，所述核酸内切酶为EcoRV、AfeI、PmlI、AfeI、NruI、PsiI、ScaI、SmaI、SspI或StuI中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述改进的启动子的‑35区至‑10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.3‑10所示。

3.一种克隆载体，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的改进的启动子；

优选地，所述载体上的lacZα基因替换为对宿主有毒性的基因；

优选地，所述对宿主有毒性的基因为转录或翻译产物能够导致宿主无法生长或增殖的基因；

优选地，所述对宿主有毒性的基因为致死基因和/或限制性内切酶基因；

优选地，所述致死基因为ccdB基因，所述ccdB基因的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；

优选地，所述克隆载体为pUC18、pUC19、pUC57、pCA、pCK、pCC或pCC1中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述载体还包括外源基因，所述外源基因可操作地连接在所述载体上；

优选地，所述外源基因为lacI表达元件，所述lacI表达元件的核酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.一种T载体，其特征在于，所述T载体为将权利要求3所述的载体制备成线性化载体后，在所述线性化载体的3’端添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸得到；

优选地，所述T载体还包括外源基因，所述外源基因可操作地连接在所述改进的启动子的核酸内切酶位点之间。

5.一种如权利要求4所述的T载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将对宿主有毒性的基因替换载体上的lacZα基因；

(2)根据要突变的核酸内切酶识别位点设计引物，以原启动子及其调控表达的基因为模板，进行PCR扩增，获得带有改进的启动子的产物；

(3)用Gibson重组的方法将步骤(2)的产物进行环化，得到带有启动子的载体；

(4)将步骤(3)所述载体进行线性化，在所述线性化的载体的3’端添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸，得到所述T载体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述引物的核酸序列如SEQ ID NO.13‑28所示；

优选地，步骤(4)所述线性化为核酸内切酶酶切和/或PCR扩增获得；

优选地，步骤(4)所述添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸采用末端转移酶和/或Taq DNA聚合酶；

优选地，步骤(1)之前还包括将对宿主有毒性的基因进行密码子优化；

优选地，步骤(1)之后还包括向所述载体上插入外源基因。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的克隆载体和/或如权利要求4所述的T载体。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为野生型大肠杆菌。

9.一种基因克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将所述外源基因的3’端添加1个A碱基，添加A碱基的外源基因与权利要求4所述T载体连接，导入宿主细胞中，在合适的条件下，培养所述宿主细胞，以便获得阳性克隆；

优选地，所述宿主细胞为野生型大肠杆菌。。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的改进的启动子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的T载体或权利要求7或8所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述试剂盒用于基因克隆。