[发明专利]一种改进的启动子及其组成的T载体和应用

权利要求书

1.一种T载体，其特征在于，所述T载体为将克隆载体制备成线性化载体后，在所述线性化载体的3’端添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸得到；

所述克隆载体包括改进的启动子；

所述改进的启动子为将β-半乳糖苷酶的启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列突变为核酸内切酶酶切形成平末端序列的识别位点；

所述β-半乳糖苷酶的启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

所述核酸内切酶为EcoRV或PmlI；

所述改进的启动子的-35区至-10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.3-10所示；

所述克隆载体上的lacZα基因替换为对宿主有毒性的基因，所述对宿主有毒性的基因为ccdB基因，所述ccdB基因的核酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述克隆载体为pUC57、pCK或pCC1中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的T载体，其特征在于，所述克隆载体还包括lacI表达元件，所述lacI表达元件可操作地连接在所述载体上；

所述lacI表达元件的核酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1或2所述的T载体，其特征在于，所述T载体还包括外源基因，所述外源基因可操作地连接在所述改进的启动子的核酸内切酶位点之间。

4.一种如权利要求3所述的T载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将对宿主有毒性的基因替换载体上的lacZα基因；

(2)根据要突变的核酸内切酶识别位点设计引物，以原启动子及其调控表达的基因为模板，进行PCR扩增，获得带有改进的启动子的产物；

(3)用Gibson重组的方法将步骤(2)的产物进行环化，得到带有启动子的载体；

(4)将步骤(3)所述载体进行线性化，在所述线性化的载体的3’端添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸，得到所述T载体；

步骤(2)所述引物的核酸序列如SEQ ID NO.13-28所示。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述线性化为核酸内切酶酶切和/或PCR扩增获得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸采用末端转移酶和/或Taq DNA聚合酶。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)之前还包括将对宿主有毒性的基因进行密码子优化。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)之后还包括向所述载体上插入外源基因。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求1-3中任一项所述的T载体。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为野生型大肠杆菌。

11.一种基因克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将外源基因的3’端添加1个A碱基，添加A碱基的外源基因与权利要求1或2所述T载体连接，导入宿主细胞中，在合适的条件下，培养所述宿主细胞，以便获得阳性克隆。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为野生型大肠杆菌。

13.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的T载体或权利要求9或10所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于基因克隆。