[发明专利]基于Lectin基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种基于Lectin基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：（1）基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，测序比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；（2）若待测样品属于C.parvum、C.hominis、C.cuniculus、horse genotype或驴源C.hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，测序比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株。本发明经序列比对及进化树结果表明，Lectin基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSU rRNA序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具。

主权项

基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）基于SSU rRNA位点的扩增：基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；       R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；       R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4；（2）基于凝集素基因Lectin位点的扩增：若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；基于Lectin基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；若两待测样品的Lectin基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种；若两待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；       R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；       R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8。