[发明专利]基于Lectin基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法

权利要求书

1.基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）基于SSU rRNA位点的扩增：基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；

基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：

外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；

R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；

内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；

R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4；

（2）基于凝集素基因Lectin位点的扩增：若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；

基于Lectin基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；

若两待测样品的Lectin基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种；若两待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；

基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：

外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；

R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；

内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；

R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8；

所述的部分隐孢子虫是指C. parvum、C. hominis、C. cuniculus及其在SSU rRNA 处与人源C. hominis 极为相近的horse genotype、驴源C. hominis。

2.根据权利要求1所述的基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤（1）中的PCR反应条件：94℃，5min，1 个循环；94℃，45 s，55℃和55℃，45 s，72℃，1min，35 个循环；72℃，10min，1 个循环。

3.根据权利要求1所述的基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤（2）中的PCR反应条件：94℃，3 min，1 个循环；94℃，30 s ，56℃和53℃，30 s，72℃，1 min，40个循环；72℃，10 min，1 个循环。

4.根据权利要求1所述的基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。