[发明专利]金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法

摘要

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌扩增引物及探针引物，金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为110的样品匀液，进行增菌培养；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析；结果表明引物（nuc和16s）分别针对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增，金黄色葡萄菌数据结果平均值为88(copies/μL)，蜡样芽胞杆菌数据结果平均值为233(copies/μL)，具有重复性；取浓度为108‑103的基因序列进行检测，灵敏度良好。

主权项

金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：1）称取25g样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打成匀液；增菌培养，金黄色葡萄球菌增菌培养按照GB/T 23743方法进行，蜡样芽胞杆菌增菌培养按照GB/T 26427方法进行；所述的样品为饲料或食品；2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；3）以提取的DNA为模板，加入金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针以及酶反应液进行双重微滴数字PCR反应；4）反应结束后，进行检测与分析；所述的金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针为：nuc基因上游引物： GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG；nuc基因下游引物： TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT；nuc探针：5’‑（FAM）‑CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC‑（BHQ1）‑3’；16s保守基因上游引物：CCTTATGACCTGGGCTACAC；16s保守基因下游引物：AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC；16s探针：5’‑（HEX）‑TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT‑（ECLIPSE）‑3’。