[发明专利]金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法。

背景技术

微滴数字PCR方法（Droplet digital PCR, dd PCR）是近年来在PCR技术基础上发展起来的另一种快速、准确、可实现DNA绝对定量一种PCR方法。在鉴别金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的工作中，微滴数字PCR检测方法是前沿的技术手段，也是最精确和最敏感的检测方法。本发明的原理是通过微滴数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据金黄色葡萄球菌的nuc特异性基因序列和蜡样芽孢杆菌的16s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴定；经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的快速定性检验。与实时荧光定量PCR方法相比，本方法无需根据外部核酸标准品，无需标准曲线，工作流程简单，又兼具实时荧光定量PCR方法的优点，可实现核酸绝对定量分析，并且又具有高通量样品处理能力，实用性强。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)均属于革兰氏阳性菌，引起症状相似，并且这两种致病菌主要来源于患病的人和动物及其带菌者，其中饲料和水源的污染是导致相互传染的主要原因。各种饲料中均可发现金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，家禽家畜感染这两种致病菌可引起相应的传染病，并且属于畜禽的常见病，发病率较高，危害很大。养殖业收入在吉林省经济总产值占有重要比重，建立饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的快速高效检测方法，对于预防检测牲畜疫情疫病，降低养殖户和牧民的经济损失，保护我省饲养业食品安全和经济利益具有十分重要的意义。因此，在饲料产品质量安全领域迫切需要开发一种快速简便地检测和鉴定金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌的技术。

在食品卫生检测工作中，对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测一直以来都是重要内容，为了更好地完成工作任务，本领域技术人员期待一种能够实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速准确并且同时检测的方法。现阶段我国没有饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的微滴数字PCR检测方法，因此本发明通过提供一种能够同时检测饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的双重微滴数字PCR法，即通过对相应基因的特异扩增，来实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测。此法是对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的相关检测标准的有益补充。如上文所述，本发明提供的双重微滴式数字PCR技术是在实时荧光PCR技术基础上发展而来的，在扩增反应体系中添加特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，保证了检测结果的可靠性，灵敏度也更高。

高营养饲料在消毒不好等情况下，易生长有害菌，可使饲料变质变色变味直至产生毒素，危害畜牧生产。金黄色葡萄球菌多为致病菌，致病力最强；蜡样芽孢杆菌，是芽孢杆菌属中的一种，易引起食物中毒。因此建立一种溯源技术来排查饲料污染，控制饲料安全的关键环节具有重要意义。确定饲料中致病菌在食物链中相关的食品，寻找预防食品污染的关键环节，具备对突发事件的反应能力，建立和完善食源性致病菌及食源性疾病的监测系统和预警系统。以上两种菌均属于革兰氏阳性菌，目前国内外鉴别金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的方法很多，现阶段我国没有饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的微滴数字PCR检测方法，微滴数字PCR检测技术是全新的技术手段，可以弥补传统培养法等现有技术的不足。

发明内容

本发明目的是为解决传统方法检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌费时、复杂等问题，而提供一种方便、快速的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法。

金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：

1）称取25g样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打成匀液；增菌培养，金黄色葡萄球菌增菌培养按照GB/T 23743方法进行，蜡样芽胞杆菌增菌培养按照GB/T 26427方法进行；所述的样品为饲料或食品；

2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；

3）以提取的DNA为模板，加入金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针以及酶反应液进行双重微滴数字PCR反应；

4）反应结束后，进行检测与分析；

所述的金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针，分别包括以下碱基序列：