[发明专利]金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法

权利要求书

1.金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：

1）称取25g样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打成匀液；增菌培养，金黄色葡萄球菌增菌培养按照GB/T 23743方法进行，蜡样芽胞杆菌增菌培养按照GB/T 26427方法进行；所述的样品为饲料或食品；

2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；

3）以提取的DNA为模板，加入金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针以及酶反应液进行双重微滴数字PCR反应；

4）反应结束后，进行检测与分析；

所述的金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针为：

nuc基因上游引物： GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG；

nuc基因下游引物： TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT；

nuc探针：5’-（FAM）-CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC-（BHQ1）-3’；

16s保守基因上游引物：CCTTATGACCTGGGCTACAC；

16s保守基因下游引物：AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC；

16s探针：5’-（HEX）-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-（ECLIPSE）-3’。

2. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的双重微滴数字PCR反应体系为：

2×dd PCR预混液10µL

10 µmol/L nuc基因上游引物1.6µL

10 µmol/L nuc基因下游引物1.6µL

10 µmol/L rfbE基因探针 0.8µL

10 µmol/L 16s保守基因上游引物0.4µL

10 µmol/L 16s保守基因下游引物0.4µL

10 µmol/L16s保守基因探针 0.2µL

1～100 ng/µL模板DNA（金黄色葡萄球菌）4µL

1～100 ng/µL模板DNA（蜡样芽孢杆菌）1µL；

所述的双重微滴数字PCR反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物。

3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，其特征在于：步骤4）中所述的反应与分析，是双重微滴数字PCR反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹模板DNA，高于阈值的微滴包裹模板DNA，为阳性微滴；低于阈值的微滴不包裹模板DNA为阴性微滴，再根据阳性微滴数计算模板DNA的拷贝数，根据阳性拷贝数值判定结果。

4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，其特征在于：所述的判定结果的方法为：

1）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因仅有一种得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因；

2）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因；

3）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均未得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性，可报告未检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，还设有空白对照、阴性对照和阳性对照，判定标准为：

1）阳性对照：以金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌阳性成分DNA为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值；

2）阴性对照：以非目标源性成分DNA为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值；

3）空白对照：以双蒸水为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。