[发明专利]微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法在审
申请号: | 201711049666.6 | 申请日: | 2017-10-31 |
公开(公告)号: | CN108070643A | 公开(公告)日: | 2018-05-25 |
发明(设计)人: | 林东旭;刘小龙;杨明燕;魏国鹏 | 申请(专利权)人: | 南京格致基因生物科技有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6869 | 分类号: | C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
代理公司: | 北京中企鸿阳知识产权代理事务所(普通合伙) 11487 | 代理人: | 郭鸿雁 |
地址: | 212028 江苏省南京市高新技术*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法涉及生物化学技术领域。其目的是为了提供一种成本低、操作简便的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法。本发明的构方法包括以下步骤:采集样本,提取DNA;扩增;纯化;定量;测序,生物信息学分析。本发明的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法成本低、操作简便,可以简化实验流程并降低测序成本。 | ||
搜索关键词: | 单分子水平 测序文库 构建 微生物 测序 生物信息学分析 生物化学技术 发明微生物 实验流程 提取DNA 扩增 样本 采集 | ||
【主权项】:
1.一种微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:(1)采集正常人粪便样本,存放于1mL粪便保存液中混匀,采用天漠公司的粪便微生物DNA提取试剂盒,按照说明书的步骤提取粪便宏基因组DNA;(2)提取后的宏基因组DNA使用微量紫外分光光度计检测样本的浓度和纯度;(3)采用英杰公司的multiplex扩增试剂进行第一步扩增;第一步扩增以粪便微生物DNA为模板扩增两个循环,保证两段连有接头完整而且单一的文库片段产生;上游引物REP1和下游引物REP2序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;(4)第二步扩增以第一次扩增的产物为模板,加入两端的P1和P2短引物进行扩增30个循环放大信号;上游引物P1和下游引物P2的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.3所示;(5)取10uL经过两步扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;(6)经过两步扩增后所得产物用Beckman&Coulter公司的AMPure XP磁珠进行纯化:向反应体系中加入75uL磁珠悬液,充分吹打混匀,室温放置5min;吸取上清废弃,使用80%的乙醇洗两次,室温放置5min晾干磁珠,加入20ul的low TE洗脱磁珠得到纯化后的测序文库;(7)纯化后的测序文库用Qubit 3.0和Agilent 2100进行精确定量和片段大小分析;(8)按照测序平台要求稀释测序文库,以Qubit 3.0定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样,最后采用Illumina HiseqX或者Miseq进行测序;(9)对测序结果进行生物信息学分析,即完成微生物16S RDNA单分子水平测序文库的构建,合并所有两端标签重复而且序列重复的reads,合并后单端标签没有重复。
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