[发明专利]微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法

摘要

本发明微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法涉及生物化学技术领域。其目的是为了提供一种成本低、操作简便的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法。本发明的构方法包括以下步骤：采集样本，提取DNA；扩增；纯化；定量；测序，生物信息学分析。本发明的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法成本低、操作简便，可以简化实验流程并降低测序成本。

主权项

1.一种微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)采集正常人粪便样本，存放于1mL粪便保存液中混匀，采用天漠公司的粪便微生物DNA提取试剂盒，按照说明书的步骤提取粪便宏基因组DNA；(2)提取后的宏基因组DNA使用微量紫外分光光度计检测样本的浓度和纯度；(3)采用英杰公司的multiplex扩增试剂进行第一步扩增；第一步扩增以粪便微生物DNA为模板扩增两个循环，保证两段连有接头完整而且单一的文库片段产生；上游引物REP1和下游引物REP2序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；(4)第二步扩增以第一次扩增的产物为模板，加入两端的P1和P2短引物进行扩增30个循环放大信号；上游引物P1和下游引物P2的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.3所示；(5)取10uL经过两步扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；(6)经过两步扩增后所得产物用Beckman&Coulter公司的AMPure XP磁珠进行纯化：向反应体系中加入75uL磁珠悬液，充分吹打混匀，室温放置5min；吸取上清废弃，使用80％的乙醇洗两次，室温放置5min晾干磁珠，加入20ul的low TE洗脱磁珠得到纯化后的测序文库；(7)纯化后的测序文库用Qubit 3.0和Agilent 2100进行精确定量和片段大小分析；(8)按照测序平台要求稀释测序文库，以Qubit 3.0定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样，最后采用Illumina HiseqX或者Miseq进行测序；(9)对测序结果进行生物信息学分析，即完成微生物16S RDNA单分子水平测序文库的构建，合并所有两端标签重复而且序列重复的reads，合并后单端标签没有重复。