[发明专利]微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法

说明书

本发明微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法涉及生物化学技术领域。其目的是为了提供一种成本低、操作简便的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法。本发明的构方法包括以下步骤：采集样本，提取DNA；扩增；纯化；定量；测序，生物信息学分析。本发明的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法成本低、操作简便，可以简化实验流程并降低测序成本。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种用生物化学方法建立化学物库的方法。

背景技术

16S rDNA测序是指对环境样本16S rDNA高变区进行PCR扩增及高通量测序的一种技术，可对特定环境下细菌和古菌的微生物种类和丰度进行有效的鉴定。通过检测16SrDNA的序列变异和丰度，反映环境样本中细菌的分类和丰度。16S序列由9个高变区(V1-V9)组成，中间穿插着保守区，目前对16S rDNA测序主要有三种方法：测单V区(V3/V4/V6)，测双V区(V3-V4或V4-V5)，测三V区(V1-V3、V5-V7、V7-V9)，或者测整个16s rDNA全序列。目前V4区在各个水平上的物种鉴定精确度最高，但双V区比单V区序列读长更长，V3-V4区是所有可变区中最长的，加起来长度有459bp，所含信息量最大，V3-V4区引物结合特异性好，在细菌和古菌中的覆盖率均高，一次测序可同时检测细菌和古菌的多样性分布，而且对于细菌分类双V区已经精确到属甚至种水平，没有必要测整个16s rDNA基因。所以综合来讲16SrDNAV3-V4区测序是微生物物种鉴定的最佳选择。

基于Illumina Miseq的16S rDNA测序或者Illumina Hiseq平台的宏基因组测序，可以一次性完成多个样本的平行测序，提供环境样本物种分类，物种丰度，种群结构，系统进化，群落比较等诸多信息。目前测序建库的方法主要以两步法和一步法为主，一步法的应用现在越来越多，优点包括操作更简单，而且减少步骤可以减少由于操作带来的误差和影响，还有从成本角度来讲一步法更节省成本。但是现有的一步法扩增没有考虑到扩增本身给结果带来的影响，因为扩增的偏好性问题，导致均一性差，不能准确的反应客观菌群的丰度。而单分子16S rDNA测序检测的优势就是可以精确到单个宏基因组模板，可以做到绝对的定量菌群丰度分析，现有的单分子16S rDNA测序技术主要是使用ion torrent的测序平台，ion torrent的测序原理本身就是通过微油滴包裹单个模板进行扩增，因此可以做到单分子级别。目前更普遍使用的illumina测序平台还不能实现16S rDNA单分子级别的测序检测分析。

因此，在保持一步法优点的基础上需要开发一种基于illumina平台可以精确到16s rDNA单分子级别的建库测序方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、操作简便的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法。

本发明涉及一种微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采集正常人粪便样本，存放于1mL粪便保存液中混匀(可以常温保存15天)，采用天漠公司的粪便微生物DNA提取试剂盒(ZYMO公司的Quick-DNATM Fecal MicrobeMicroprep Kit)，按照说明书的步骤提取粪便宏基因组DNA；

(2)提取后的宏基因组DNA使用微量紫外分光光度计检测样本的浓度和纯度；

(3)采用英杰公司的multiplex扩增试剂(Invitrogen的Multiplex PCR mastermix)进行第一步扩增；上游引物REP1和下游引物REP2序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；如图1所示；

第一步扩增以粪便微生物DNA为模板扩增两个循环，保证两段连有接头完整而且单一的文库片段产生；