[发明专利]微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)采集正常人粪便样本，存放于1mL粪便保存液中混匀，采用天漠公司的粪便微生物DNA提取试剂盒，按照说明书的步骤提取粪便宏基因组DNA；

(2)提取后的宏基因组DNA使用微量紫外分光光度计检测样本的浓度和纯度；

(3)采用英杰公司的multiplex扩增试剂进行第一步扩增；

第一步扩增以粪便微生物DNA为模板扩增两个循环，保证两段连有接头完整而且单一的文库片段产生；上游引物REP1和下游引物REP2序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(4)第二步扩增以第一次扩增的产物为模板，加入两端的P1和P2短引物进行扩增30个循环放大信号；上游引物P1和下游引物P2的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.3所示；

(5)取10uL经过两步扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

(6)经过两步扩增后所得产物用Beckman&Coulter公司的AMPure XP磁珠进行纯化：向反应体系中加入75uL磁珠悬液，充分吹打混匀，室温放置5min；吸取上清废弃，使用80％的乙醇洗两次，室温放置5min晾干磁珠，加入20ul的low TE洗脱磁珠得到纯化后的测序文库；

(7)纯化后的测序文库用Qubit 3.0和Agilent 2100进行精确定量和片段大小分析；

(8)按照测序平台要求稀释测序文库，以Qubit 3.0定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样，最后采用Illumina HiseqX或者Miseq进行测序；

(9)对测序结果进行生物信息学分析，即完成微生物16S RDNA单分子水平测序文库的构建，合并所有两端标签重复而且序列重复的reads，合并后单端标签没有重复。

2.根据权利要求1所述的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，其特征在于：所述微量紫外分光光度计型号为Nanodrop 2000。

3.根据权利要求2所述的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)第一步扩增的23μL PCR反应体系如表1所示：

表1 第一步扩增的23μL PCR反应体系

成分组成体积/DNA量Multiplex扩增试剂11.5ul上游引物REP1，浓度为10uM1ul下游引物REP2，浓度为10uM1ul微生物基因组DNA3ng水补足23ul

第一步扩增反应程序如表2所示：

表2 第一步扩增反应程序

4.根据权利要求3所述的微生物16S rDNA单分子水平测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)第二步扩增的50μL PCR反应体系如表3所示：

表3 第二步扩增的50μL PCR反应体系

成分组成体积/DNA量第一步扩增体系23uLMultiplex PCR master mix25uL上游引物P1，浓度为10uM1uL下游引物P2，浓度为10uM1uL

第二步扩增反应程序如表4所示：

表4 第二步扩增反应程序