[发明专利]基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒

摘要

本发明公开了基于免疫磁珠和MnO₂纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，制备具有超顺磁性的磁珠，将该磁珠与副溶血性弧菌多克隆抗体偶联；合成MnO₂纳米粒子，将该纳米粒子与副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体偶联；取待测液，将其与两种探针混合，使用磁力架分离磁珠‑菌体‑MnO₂复合物，用柠檬酸盐缓冲液重悬该混合物，加入TMB显色，从而实现副溶血性弧菌快速特异性检测。该发明提出利用免疫磁珠和MnO₂纳米粒子技术对副溶血性弧菌检测，利用ELISA方法的免疫学反应显色，缩短了检测时间，定量检测时变异系数小。最低检测浓度为10CFU/mL，加标回收率达到96.7%，灵敏度高，稳定性好。

主权项

1.基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：羧基化Fe3O4纳米粒子与抗副溶血性弧菌兔多抗偶联的免疫磁珠和MnO2纳米粒子与抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY偶联的MnO2纳米探针；所述的羧基化Fe3O4纳米粒子由下述方法制备：添加1.08g FeCl3.6H2O到22mL乙二醇中，超声溶解10min；再添加1.2g NaAc和0.2g柠檬酸钠超声10min；最后，添加0.2g PEG6000于上述溶液中，超声混匀，将所得均质溶液转移至反应釜中，于199℃烘箱中反应18h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗3‑5次，得到羧基化Fe3O4纳米粒子；所述的免疫磁珠由下述方法制备：取0.5mg羧基化Fe3O4纳米粒子，用PBS洗2次，用1mL PBS重悬，加入10mg EDC和10mg NHS活化羧基，30min后，磁吸附，去上清，PBS洗3次，1mL PBS重悬，加入50µg抗副溶血性弧菌兔多抗，室温反应2h，磁分离，去上清，PBS洗3次，加入1mL封闭液封闭1h，得到功能化免疫磁珠；所述的MnO2纳米粒子由下述方法制备：添加25mg牛血清白蛋白于10mL PBS中，搅拌混匀，加入100µL0.1MMnSO4.H2O于混合液中，搅拌2min，再向其加入1M的NaOH 100µL ，搅拌6‑7h后，用超纯水透析48h，15000rpm离心，得到MnO2纳米粒子；所述的MnO2纳米探针由下述方法制备：取1mg MnO2纳米粒子，PBS重悬，加入1mg EDC和1.5mg NHS活化15min，加入50µg抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY，反应2h，15000 rpm离心，得到功能化MnO2纳米探针。