[发明专利]基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒

说明书

本发明公开了基于免疫磁珠和MnO₂纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，制备具有超顺磁性的磁珠，将该磁珠与副溶血性弧菌多克隆抗体偶联；合成MnO₂纳米粒子，将该纳米粒子与副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体偶联；取待测液，将其与两种探针混合，使用磁力架分离磁珠‑菌体‑MnO₂复合物，用柠檬酸盐缓冲液重悬该混合物，加入TMB显色，从而实现副溶血性弧菌快速特异性检测。该发明提出利用免疫磁珠和MnO₂纳米粒子技术对副溶血性弧菌检测，利用ELISA方法的免疫学反应显色，缩短了检测时间，定量检测时变异系数小。最低检测浓度为10CFU/mL，加标回收率达到96.7%，灵敏度高，稳定性好。

技术领域

本发明属微生物检测领域，具体涉及基于免疫磁珠和MnO₂纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种革兰氏阴性非芽孢嗜盐菌，是常见的食源性致病菌之一。该菌主要来源于虾，鱼和贝类等海产品中，主要通过污染的海产品引起人类急性胃肠炎、伤口感染和败血症等。近几年来，随着食用海产品的人群在不断扩增，由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趋势，据报道，自1998年以来，副溶血性弧菌引起的食物中毒已超过沙门菌食物中毒，成为最严重的食源性病原菌。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌。

当前，我国副溶血性弧菌的传统检测方法以微生物培养法为主，全程大概需要5-8天，操作繁琐，耗时长，已不能满足人们对食品安全检测快速简便的要求。随着技术的不断进步，推动着检测方法的不断发展，越来越多的方法应用于检测副溶血性弧菌，如PCR技术、酶联免疫吸附法（ELISA）、环介导等温扩增技术（LAMP）等。PCR技术可在短时间内放大检测目标，具有灵敏度高的特点，但是PCR操作过程要求高且易出现假阳性。ELISA法利用抗原-抗体的特异性结合检测，对设备要求低，但是耗时长，灵敏度相对而言较低。LAMP作为一个新兴的检测技术，具有费用低，灵敏度高，特异性高等特点，但是LAMP需要先选择性增菌培养，因此不利于样品的现场检测，而且有可能进入新的污染。所以，非常必要有开发一种快速，灵敏度高，特异性强的检测手段，来监控食源性致病菌，以保障人们的食品安全。

发明内容

本发明目的是提供一种快速、灵敏、简便的副溶血性弧菌检测的基于免疫磁珠和MnO₂纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒。

基于免疫磁珠和MnO₂纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒，它包括：羧基化Fe₃O₄纳米粒子与抗副溶血性弧菌兔多抗偶联的免疫磁珠和MnO₂纳米粒子与抗副溶血性弧菌特异性鸡卵黄抗体IgY偶联的MnO₂纳米探针。

快速检测食品副溶血性弧菌的方法，它包括：

1）纳米磁珠的制备：

添加1.08g FeCl₃.6H₂O到22mL乙二醇中，超声溶解10min，；再添加1.2g NaAc和0.2g柠檬酸钠超声10min，；最后，添加0.2g PEG6000于上述溶液中，超声混匀，将所得均质溶液转移至反应釜中，于199℃烘箱中反应18h；用永磁铁从反应溶液中分离中黑色的固体物质，用超纯水和乙醇交替清洗3-5次，得到羧基化Fe₃O₄纳米粒子；

2）免疫磁珠的制备：