[发明专利]一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法

摘要

本发明公开了一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，先提取环境样品中的DNA，获取DNA样品，通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度，再通过第二代高通量测序方法获得环境样品中微生物不同界、门、纲、目、科、属、种的分类基因相对丰度，最后将DNA样品的分类基因总浓度与微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，实现了微生物群落结构绝对丰度的高通量快速测定，使得跨样本比较更为可靠，实质反映物种的增长与减少，为进一步探究微生物群落结构提供技术支撑。

主权项

1.一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，包括如下步骤：（1）提取环境样品中的DNA，获取DNA样品；（2）通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度；所测微生物为细菌或古菌时，分类基因为16S rRNA基因；所测微生物为真菌时，分类基因为ITS基因；所述的步骤（2）中，包括如下步骤：（2‑1）制备质粒标准样品；（2‑2）计算质粒标准品的拷贝数；（2‑3）样品分类基因浓度实时荧光定量PCR测定；所述的样品分类基因浓度实时荧光定量PCR测定包括如下步骤：（2‑3‑1）将已知浓度的质粒标准品通过10倍梯度稀释，构建浓度为10⁹， 10⁸， 10⁷， 10⁶， 10⁵， 10⁴， 10³，10² copies μL^‑1标准曲线标准样；（2‑3‑2）将土壤样品DNA与10倍梯度稀释质粒标准样一同进行实时荧光定量PCR测定，获得Ct值；（2‑3‑3）利用统计学中的线性回归方法将10倍梯度稀释质粒标准样的Ct值与拷贝数对数进行方程拟合，得到标准曲线；（2‑3‑4）将土壤DNA样品Ct值代入（2‑3‑3）中标准曲线中，计算DNA样品分类基因浓度；（3）通过第二代高通量测序方法对DNA样品进行分类基因扩增子高通量测序，获得环境样品中微生物不同界、门、纲、目、科、属、种的分类基因相对丰度；（4）将步骤（2）的DNA样品的分类基因总浓度与步骤（3）的微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，从而获得环境中微生物群落的绝对丰度。