[发明专利]一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法

权利要求书

1.一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，包括如下步骤：

（1）提取环境样品中的DNA，获取DNA样品；

（2）通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度；

所测微生物为细菌或古菌时，分类基因为16S rRNA基因；所测微生物为真菌时，分类基因为ITS基因；

所述的步骤（2）中，包括如下步骤：

（2-1）制备质粒标准样品；

（2-2）计算质粒标准品的拷贝数；

（2-3）样品分类基因浓度实时荧光定量PCR测定；

所述的样品分类基因浓度实时荧光定量PCR测定包括如下步骤：

（2-3-1）将已知浓度的质粒标准品通过10倍梯度稀释，构建浓度为10⁹， 10⁸， 10⁷， 10⁶，10⁵， 10⁴， 10³，10² copies μL^-1标准曲线标准样；

（2-3-2）将土壤样品DNA与10倍梯度稀释质粒标准样一同进行实时荧光定量PCR测定，获得Ct值；

（2-3-3）利用统计学中的线性回归方法将10倍梯度稀释质粒标准样的Ct值与拷贝数对数进行方程拟合，得到标准曲线；

（2-3-4）将土壤DNA样品Ct值代入（2-3-3）中标准曲线中，计算DNA样品分类基因浓度；

（3）通过第二代高通量测序方法对DNA样品进行分类基因扩增子高通量测序，获得环境样品中微生物不同界、门、纲、目、科、属、种的分类基因相对丰度；

（4）将步骤（2）的DNA样品的分类基因总浓度与步骤（3）的微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，从而获得环境中微生物群落的绝对丰度。

2.根据权利要求1所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，采用MoBio PowerSoil^® DNA提取试剂盒提取环境样品中的DNA。

3.根据权利要求1所述的环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，其特征在于，所述的（2-1）制备质粒标准样品包括如下步骤：

（2-1-1）选用相应的引物对分类基因进行PCR扩增，获取目的基因片段；

（2-1-2）采用TA克隆试剂盒将（2-1-1）中目的基因片段与质粒载体相连，并将该质粒载体导入DH5α感受态细胞中；

（2-1-3）将（2-1-2）中50 μL含有质粒的DH5α感受态细胞置于300 μL液体LB培养基中，在37 ℃、250 rpm条件下培养1 h；

（2-1-4）吸取200 μL（2-1-3）中培养液，涂布于含有终浓度为100 μg mL^-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃静置过夜培养；

（2-1-5）随机挑选6-8个重组单克隆菌落分别涡旋于10 μL无菌水中；

（2-1-6）分别吸取1 μL（2-1-5）中菌悬液作为模板采用M13引物：正向引物为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；反向引物为5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’，进行PCR扩增，并对所得的PCR产物进行测序，剩余9 μL菌悬液加于含有氨苄青霉素浓度为100 μg mL^-1液体LB培养基中，37 ℃、250 rpm条件下培养12-18 h后，吸取500 μL菌液保存于-80 ℃环境中；

（2-1-7）将测定序列结果与NBCI数据中序列进行BLAST比对，选择1株成功导入分类基因序列的重组单克隆菌株；

（2-1-8）吸取200 μL（2-1-7）中所选取的重组单克隆菌株，加入20 mL含有氨苄青霉素浓度为100 μg mL^-1液体LB培养基中37 ℃、250 rpm条件下培养12-18 h；

（2-1-9）吸取4 mL（2-1-8）中菌液进行质粒提取，获得质粒标准品。