[发明专利]一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法

摘要

本发明提供了一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价的方法。该方法以动物皮为原料，制备富含油脂的皮粉底物；在水介质中，脂肪酶与皮粉吸附的油脂接触，催化皮粉内的油脂水解生成脂肪酸，在一定条件下反应后，同时用盐和酸终止酶反应，并使浴液中的脂肪酸盐转变成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附。用溶剂完全抽提皮粉中生成的脂肪酸，通过测定单位时间脂肪酸的产生量来对脂肪酶活力及性能进行表征。该方法可以在较宽pH范围测定脂肪酶的活力及对脂肪酶性能进行评价，所用底物和反应条件与动物皮处理过程中脂肪酶对皮内油脂作用的条件相近，测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等脂肪酶应用领域中的脂肪酶的选择和应用条件的优化更具有指导意义。

主权项

一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，所述方法包括以下的富含油脂皮粉底物的制备方法和脂肪酶活力的测定及性能评价方法；所用材料按照质量份计；（1）富含油脂皮粉底物的制备：方法1：取油脂含量高的动物皮（如猪皮、绵羊皮和牛皮等，包括新鲜皮、盐腌或冷冻保存的动物皮等）100份，充分水洗后，放入转鼓或振荡器中，加入100‑500份水，在15‑30℃下转动或振荡60‑240min后，浸泡或间隙转动3‑12h；换水，加50‑100份水和蛋白酶进行脱毛，脱毛液中蛋白酶的酶活力为50‑250U/mL，20‑30℃下间歇转动3‑24h，毛完全松动并去除后，将皮充分水洗，再经溶剂脱水‑自然干燥或冷冻干燥后，剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50‑150目筛，得到油脂含量为5%‑40%的皮粉底物；方法2：取按常规制革工艺制备的动物皮的二层（中间层）碱皮（如猪皮、绵羊皮和牛皮等二层碱皮）100份，按常规工艺脱灰后，放入转鼓或振荡器中，20‑35℃下，加入30‑100份水和0.5‑2.0份脱钙剂，脱钙剂为EDTA钠盐、柠檬酸钠、乳酸钠中的至少一种，转动30‑120min，对皮进行脱钙处理，将脱钙后的二层皮充分水洗，再经溶剂脱水‑自然干燥或冷冻干燥后，剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50‑150目筛，得到皮粉；在索氏抽提器中， 80‑85℃下，以二氯甲烷为溶剂，抽提4‑6h，抽提出皮粉中的油脂，得到完全脱脂皮粉；向脱脂皮粉中加入皮粉质量的10%‑50%的油脂或油脂和脂肪酸的混合物，混合均匀后，将吸附油脂的皮粉充分水洗后晾干，再研磨，过50‑150目筛，得到油脂含量为5%‑40%的皮粉底物；（2）脂肪酶活力的测定和性能评价方法，包括以下步骤：步骤1：准确称取制备的富含油脂皮粉底物3‑5g，加入烧杯或三角瓶中，加入皮粉质量20倍的缓冲液，放入振荡器中，20‑30℃下振荡1‑5h，至皮粉完全润湿；步骤2：将待测脂肪酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，并稀释至适当的倍数；将已完全润湿的皮粉底物和酶溶液在恒温振荡器中预热至设定的温度，取待测酶溶液1mL，振荡下加入底物浴液中，酶的加入量为底物浴液中脂肪酶活力浓度为5‑10U/mL；在设定温度下振荡反应至适当的时间后，立即加入适量氯化钠或其他中性盐、0‑10mL的6mol/mL盐酸或其他相当酸度的酸溶液，使反应浴液中盐的浓度达到6%（w/v）以上，pH至2.0以下，继续震荡5min，终止酶反应，并使浴液中的脂肪酸盐转变成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附；步骤3：用滤布过滤出反应液中的皮粉，将皮粉收集，自然晾干或在真空烘箱内干燥（40‑50℃），再次用粉碎机将干燥后的皮粉打散；准确称量2‑4g干燥后的皮粉，在索氏抽提器中， 80‑85℃下，以二氯甲烷为溶剂，抽提皮粉中的油脂4‑6h；蒸干抽提瓶中的二氯甲烷溶剂后，向抽提瓶中加入预先中和过的中性乙醚‑95%乙醇混合溶剂（2:1，v/v），溶解抽提物，再加入2~3滴酚酞指示剂，然后用KOH标准溶液进行滴定，准确记录消耗的KOH标准溶液体积；步骤4：空白对照样：在步骤2中用相同体积的缓冲液代替酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，其他操作相同；步骤5：脂肪酶活力的计算：脂肪酶活力定义：1g固体酶，一定条件下（一定的温度和pH值）水解脂肪，每分钟产生1μmol脂肪酸，即为1个活力单位，以u/g表示；脂肪酶活力计算公式：X = (V‑V0) ×C×W1×n×1000/( W2×t)式中：X—样品的酶活力，u/g；V—滴定样品时消耗的KOH标准溶液的体积，mL；V0—滴定空白时消耗的KOH标准溶液的体积，mL；C—KOH标准溶液浓度，mol/LW1—称取的富含油脂皮粉底物的质量，g；W2—酶处理后抽提皮粉的质量，g；n—酶样品的稀释倍数；t—反应时间，min；1000—mmol转化为μmol的系数。