[发明专利]DLO Hi-C染色体构象捕获方法

摘要

本发明公开了一种DLO Hi‑C染色体构象捕获方法，该技术克服了传统染色体构象捕获技术(Hi‑C)噪音大、成本高、实验过程繁琐、成功率低以及数据分析难度大等一系列缺陷，只需要简单的酶切酶连就可以进行实验。本发明的创新点在于:1)使用EGS和甲醛水溶液对目的细胞进行双交联，避免了后期实验过程中解交联的发生；2)实验过程中不需要生物素标记，很大程度上节约了成本；3)用时短，只需要进行简单的酶切酶连步骤，文库2天半时间就可以构建完成；4)数据噪音更小，用page胶通过片段大小选择来回收目的基因互作片段，测序所得数据基本上都是有效数据；5)首次的提出文库质量评价标准，在高通量测序之前就可以判断文库的质量。

主权项

1.一种DLO Hi-C染色体构象捕获方法，其特征在于：/n1）将目的细胞离心，然后用EGS和甲醛水溶液对目的细胞进行双交联，终止交联反应，离心分离溶解得到两管细胞；/n2）分别对步骤1）得到两管细胞进行裂解，提取得到基因组-蛋白复合物A和基因组-蛋白复合物B；/n3）选取一种限制性内切酶分别对两管基因组-蛋白复合物A和基因组-蛋白复合物B进行酶切消化，得到酶切产物A和酶切产物B；/n4）将酶切产物A和酶切产物B与对应的双链核苷酸序列LinkerA和双链核苷酸序列LinkerB连接，将LinkerA和LinkerB分别连到酶切产物A和酶切产物B的-内切酶粘性末端上；离心分离得到酶连产物A和酶连产物B；其中，双链核苷酸序列LinkerA和双链核苷酸序列LinkerB上均含有内切酶酶切位点，且内切酶酶切位点的识别位点和切割位点不在同一位点上；其中，所述步骤4）中，所述双链核苷酸序列Linker A和双链核苷酸序列Linker B上均含有内切酶酶切位点为MmeI；/n所述步骤4）中，所述双链核苷酸序列LinkerA和双链核苷酸序列LinkerB如下所述：/n /n酶连体系中包括限制性内切酶 NEB和T7 DNA连接酶；/n5）将酶连产物A和酶连产物B离心沉淀混合悬浮于500 μl的ddH₂O中，来回吹打溶解，得到DNA-蛋白复合物；/n6）向DNA-蛋白复合物中加入T4 DNA ligase buffer、Triton X-100、低熔点琼脂糖和T4 DNA 连接酶，待管内琼脂糖凝固后酶连反应8~10 h，酶连反应结束后，将离心管置于水浴锅中将低熔点琼脂糖融化，再加入琼脂糖酶消化琼脂糖；浓缩至1 ml，再加入SDS水溶液和蛋白酶K消化蛋白解交联，消化结束后酚仿抽提DNA，将提取的DNA溶于ddH₂O中，测定浓度，得到的DNA即为DLO Hi-C 总DNA；/n7）将DLO Hi-C 总DNA用识别位点和切割位点不在同一位点的内切酶进行酶切；酶切反应结束后，点样于非变性page胶中跑胶分离酶切释放出来长度为70~90 bp的DLO Hi-C DNAfragment；切胶回收得到跑胶结束后用gel-red染色，并在紫外下切胶回收长度为70~90 bp的DLO Hi-C DNA fragment；/n8）在DLO Hi-C DNA fragment片段上连接高通量测序的测序接头，得到DLO Hi-C PCR模板；/n9）根据DLO Hi-C PCR模板设计高通量测序引物对，扩增回收即得到DLO Hi-Clibrary；/n10）将DLO Hi-C library进行高通量测序，分析目的细胞中基因组的三维结果。/n