[发明专利]一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法

摘要

本发明涉及一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，具体步骤包括样品采集、样品处理、稀释样品、细胞分离、超声波处理、淀粉降解微生物的标定和示踪和显微镜观察等步骤。该方法可以应用于烤烟不同品种、不同部位、不同成熟度档次的烟叶，获得在原位状态下烟叶淀粉降解菌群的信息，较大地降低了劳动强度，成本较低，操作过程简便，操作人员不需要特殊的培训，对采样的地点无特殊的要求，实验结果准确无误，能迅速提供给技术人员相关的数据。同时，该方法也有助于技术人员弄清具体的烟叶发酵增香机理，以便更好地指导实践、探索和完善烟叶处理的工艺措施和条件、拓宽创新烟叶发酵技术研究思路、积极开展与之相关的新领域研究。

主权项

1.一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)样品采集：戴无菌手套并使用一次性的无菌收集袋随机收集烘烤或者陈化过程中的烟叶样品，并保存于18‑40度恒温条件下在20min内进行样品处理；(2)样品处理：用浓度70％酒精消毒剪刀，在无菌条件下，将烟叶样品用消毒过的剪刀剪成若干小块，并仔细除去烟叶的茎和叶脉等无用组织；(3)稀释样品：无菌条件下，称取新鲜的碎叶样品，加入到pH4 .0‑9 .0灭菌1×PBS缓冲液中，缓冲液用量为碎叶样品质量的10‑30倍，与碎叶样品混合均匀；(4)细胞分离：将步骤(3)得到的混匀液体分三次分别倒入搅拌机搅拌打碎，每次1‑5分钟，然后将三次打碎后的液体混合后倒入搅拌机高速档匀浆，过滤，将滤液离心并去除上清液，将去除上清液的沉淀物重新悬浮于装有pH4.0‑9.0为灭菌1×PBS缓冲液的离心管中，得到细胞悬浮液；所述将混匀的液体分三次分别倒入家用搅拌机搅拌打碎，每次3分钟，然后将三次打碎后的混合液体转入到无菌BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器3档匀浆3min，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，将滤液收集在无菌的50ml离心管中，5000g离心8min去除上清液，并将沉淀物放入2ml离心管中，重新悬浮于装有pH4.0‑9.0的灭菌1×PBS缓冲液中；(5)超声波处理：将离心管放入超声波仪器中固定，在确保超声波处理时离心管不会移动的前提下，用10000‑80000Hz的频率处理50‑140分钟后取出待用；在等待下一步的处理过程中，将装有细胞悬浮液的离心管储存于4℃的冰箱中；(6)淀粉降解微生物的标定和示踪：经离心处理并去除上清液的细胞悬浮液中，依次加入6‑15mmol/L、pH 5.1‑9.0灭菌的1×Tris‑HCl缓冲液和灭菌氟化硼二吡咯类荧光染料BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液，形成混合液体，并立即将混合液体转入到无菌的宽底血清瓶中，加入灭菌电子传递链抑制剂，将盖子盖好，用铝箔包严避光；室温摇动30‑120min，速度保持在100‑500rpm进行培养；无菌环境下吸取10‑50μL培养得到的反应液均匀涂布于明胶涂层载玻片上，并在无菌环境中避光风干；所述电子传递链抑制剂为1‑10mmol/L叠氮化钠、1‑10mmol/L氟乙酸钠和1‑10mmol/L碘代乙酰胺钠组成的混合溶液；所述明胶涂层载玻片按如下步骤处理：(1)取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中；在3.5L蒸馏水中加入4‑5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸10min；取出载玻片架，晾3min；用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干；(2)在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至60‑80℃，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min；取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得；(3)显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上，100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，呈现绿色荧光即为淀粉降解细菌。