[发明专利]一种鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属病毒的方法

摘要

本发明属于病毒分离与鉴定技术领域，具体涉及一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属（Potyvirus）具体病毒种类的方法。该方法使用时包括：提取病毒、电镜观察、电泳并染色、质谱分析、DNA测序、结果判定等步骤。本申请可用于零背景材料鉴定，能够较为迅速和准确的鉴定出样品中是否含有马铃薯Y病毒属病毒；而且即使针对混合样病毒样品时，采用本发明，也可快速和准确的鉴定出样品中是否含有两种或两种以上的病毒，可以较好避免病毒株系强弱对于病毒鉴定的影响。同时就检测成本而言，本申请所提供的质谱‑DNA联用方法更加经济可行，因而具有一定的推广应用价值。

主权项

一种质谱与DNA测序联用鉴定辣椒上马铃薯Y病毒属病毒的方法，其特征在于，所述马铃薯Y病毒属病毒具体包括：辣椒脉斑驳病毒、辣椒环斑病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、辣椒斑驳病毒和干辣椒脉斑驳病毒，鉴定时具体包括如下步骤：（1）处理样品，获得病毒分离物；提取步骤按照《辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备》中操作，获得病毒提纯液；（2）病毒电镜观察：取步骤（1）中的提纯后病毒提纯液置于2%磷钨酸溶液中负染，透射电镜进行观察拍照；（3）电泳并染色：对步骤（1）中所获得的病毒提纯液进行SDS‑PAGE不连续胶电泳，并进行染色，脱色后进行UVP凝胶成像系统扫描分析；（4）质谱分析鉴定，对步骤（3）中电泳后胶条初步分析，将含有马铃薯Y病毒属病毒的胶条进行切割，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析；依据质谱结果，选择NCBInr全库中的NCBInr_virus对质谱结果进行检索比对；（5）DNA测序以对病毒核酸进行鉴定，具体为：利用蛋白酶K对步骤（1）中所制备的病毒提纯液中的病毒颗粒进行消化，然后利用酚仿抽提、乙醇沉淀的方法获得纯化的病毒RNA；将提纯的病毒RNA用反转录酶合成cDNA第一链；根据步骤（4）中的蛋白质搜索鉴定结果，选择适当的引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增；将扩增得到的产物回收后连于pMD18T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定；将初步鉴定为阳性的克隆菌进行测序分析；（6）结果判定：电镜观察中，如果观察到680~900 nm长、11~13 nm宽的弯曲线状病毒颗粒，则可初步判定辣椒病样为马铃薯Y病毒属病毒感染样品；依据电泳结果的初步质谱分析，及后续的检索比对结果，进一步缩小待鉴定的病毒范围，并初步确定感染辣椒病样的病毒是哪一种或哪几种；进一步根据质谱分析的结果，设计特异引物进行RT‑PCR扩增和测序，最终确定感染辣椒病样的病毒类型。