[发明专利]一种猕猴桃溃疡病菌活菌的检测方法

摘要

本发明提供了一种检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,以检猕猴桃枝干为检测样品，通过切块、清洗消毒、增殖培养、曝光等步骤，并具体公开所采用的特异引物、试剂、工艺参数等，能特异、快速、准确检测枝干样品中猕猴桃溃疡病菌的方法，克服了常规PCR方法的假阳性和假阴性。

主权项

一种检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,包括以下步骤：（1）将待检猕猴桃枝干洗净后切成小块，无菌水清洗后，分别用1％的次氯酸钠和70％乙醇消毒，再用无菌水冲洗；（2）将样品在无菌条件下碾碎后加入无菌蒸馏水浸泡2 h，取上清液接种到LB液体培养基中，25℃ 250r/min摇床培养8h；（3）取增殖培养后的培养液避光添加终浓度为3μg/mL的EMA，再室温避光静置5 min，再置于冰上，距离650W卤钨灯15cm，持续曝光10 min；以增殖培养后的培养液热致死处理，即100℃水浴加热10 min后，再避光添加终浓度为3μg/mL 的EMA作为对照；（4）取步骤（3）曝光处理后的菌液8000r/min离心5min，弃上清液，加无菌蒸馏水混匀，以菌液作为PCR模板；（5）以引物PsaF1（5'‑TTTTGCTTTGCACACCCGATTT‑3'）和PsaR2（5'–CACGCACCCTTCAATCAGGATG‑3'），以步骤（4）的菌液为模板，进行PCR扩增；反应体系为25 µL，其中包括5U/μL的Taq聚合酶0.3μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL,10×reaction Buffer 2.5μL,引物PsaF1/PsaR2（10mmol/L）各0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL,模板2.5μl，加超纯水补至25 μL；PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃15s，58℃30s，72℃30s,32个循环，最后72℃延伸5min；琼脂糖电泳检测，出现条带表明存在活菌（+），没有出现条带则表明没有活菌（‑）。