[发明专利]一种猕猴桃溃疡病菌活菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。

背景技术

猕猴桃溃疡病是由丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae，Psa)引起，是猕猴桃生产中最严重的病害之一。目前，猕猴桃疡病菌的检测 已广泛应用PCR技术，但是传统的PCR检测技术不仅能扩增活菌的DNA，自由状态的DNA或死 菌DNA也能被扩增，导致检测出现假阳性。而且，目前的检测方法是以菌体为检测样本，不能 直接以猕猴桃树为检测对象，以植株为对象进行检测目标菌不易被检测，难度大，干扰因素 多，不易操作和推广。

叠氮溴乙锭(Ethidiummonoazidebromide，EMA)是一种染料，能够与核酸结合， 当光解后生成的氮宾化合物能够穿过死菌的细胞膜，与菌体DNA发生不可逆共价结合，PCR 扩增被抑制，但不会抑制细胞膜完整的活菌PCR扩增。EMA-PCR方法仅以活菌DNA分子为检测 靶标，克服了传统PCR检测假阳性较高的缺点，使结果更加有效、可靠。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能特异、快速、准确检测枝干样品中猕猴桃溃疡病菌 的方法，克服了常规PCR方法的假阳性和假阴性。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法，包括以下步骤：

(1)将待检猕猴桃枝干洗净后切成小块，无菌水清洗后，分别用1％的次氯酸钠和 70％乙醇消毒，再用无菌水冲洗；

(2)将样品在无菌条件下碾碎后加入无菌蒸馏水浸泡2h，再进行增殖培养，即取上 清液接种到LB液体培养基中，25℃250r/min摇床培养8h；

(3)取增殖培养后的培养液避光添加终浓度为3μg/mL的EMA，以增殖培养后的培养 液热致死处理，即100℃水浴加热10min后，再避光添加终浓度为3μg/mL的EMA作为对照；再 室温避光静置5min，再置于冰上，距离650W卤钨灯15cm，持续曝光10min；

(4)取步骤(3)曝光处理后的菌液8000r/min离心5min，弃上清液，加无菌蒸馏水混 匀，以菌液作为PCR模板；

(5)以引物PsaF1(5’-TTTTGCTTTGCACACCCGATTT-3’)和PsaR2(5’- CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’)，以步骤(4)的菌液为模板，进行PCR扩增；反应体系为25μL， 其中包括5U/μL的Taq聚合酶0.3μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL，10×reactionBuffer2.5μL， 引物PsaF1/PsaR2(10mmol/L)各0.5μL，25mmol/LMgCl₂1.5μL，模板2.5μl，加超纯水补至 25μL；PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃15s，58℃30s，72℃30s，32个循环，最后72℃延 伸5min；琼脂糖电泳检测，出现条带表明存在活菌(+)，没有出现条带则表明没有活菌(-)。

上述检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法，包括以下步骤：

(1)将待检猕猴桃枝干洗净后切成4mm×4mm的小块，无菌水清洗3次后分别用1％ 的次氯酸钠和70％乙醇消毒1min，再用无菌水冲洗3次；

(2)将样品在无菌条件下碾碎后加入无菌蒸馏水0.8mL浸泡2h，取上层浸泡液 0.4mL接种到10mLLB液体培养基中，25℃250r/min摇床培养8h；

(3)取增殖培养后的培养液避光添加终浓度为3μg/mL的EMA；以增殖培养后的培养 液热致死处理，即100℃水浴加热10min后，再避光添加终浓度为3μg/mL的EMA作为对照；再 室温避光静置5min，再置于冰上，距离650W卤钨灯15cm，持续曝光10min；(4)PCR模板制备： 取经EMA曝光处理后的菌液1mL，8000r/min离心5min，弃上清液，加0.01mL无菌蒸馏水混匀， 以菌液作为PCR模板；