[发明专利]一种猕猴桃溃疡病菌活菌的检测方法

权利要求书

1.一种检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,包括以下步骤：

（1）将待检猕猴桃枝干洗净后切成小块，无菌水清洗后，分别用1％的次氯酸钠和70％ 乙醇消毒，再用无菌水冲洗；

（2）将样品在无菌条件下碾碎后加入无菌蒸馏水浸泡2h，取上清液接种到LB液体培养 基中，25℃250r/min摇床培养8h；

（3）取增殖培养后的培养液避光添加终浓度为3μg/mL的EMA，再室温避光静置5min，再 置于冰上，距离650W卤钨灯15cm，持续曝光10min；以增殖培养后的培养液热致死处理，即 100℃水浴加热10min后，再避光添加终浓度为3μg/mL的EMA作为对照；

（4）取步骤（3）曝光处理后的菌液8000r/min离心5min，弃上清液，加无菌蒸馏水混匀， 以菌液作为PCR模板；

（5）以引物PsaF1（5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTT-3'）和PsaR2（5'–CACGCACCCTTCAATCAGGATG- 3'），以步骤（4）的菌液为模板，进行PCR扩增；反应体系为25μL，其中包括5U/μL的Taq聚合 酶0.3μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL,10×reactionBuffer2.5μL,引物PsaF1/PsaR2 （10mmol/L）各0.5μL，25mmol/LMgCl₂1.5μL,模板2.5μl，加超纯水补至25μL；PCR反应程 序为：94℃预变性2min；94℃15s，58℃30s，72℃30s,32个循环，最后72℃延伸5min；琼脂糖 电泳检测，出现条带表明存在活菌（+），没有出现条带则表明没有活菌（-）。

2.如权利要求1所述的检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,包括以下步骤：

（1）将待检猕猴桃枝干洗净后切成4mm×4mm的小块，无菌水清洗3次后分别用1％的次 氯酸钠和70％乙醇消毒1min，再用无菌水冲洗3次；

（2）将样品在无菌条件下碾碎后加入无菌蒸馏水0.8mL浸泡2h，取上层浸泡液0.4mL接 种到10mLLB液体培养基中，25℃250r/min摇床培养8h；

（3）取增殖培养后的培养液避光添加终浓度为3μg/mL的EMA；以增殖培养后的培养液热 致死处理，即100℃水浴加热10min后，再避光添加终浓度为3μg/mL的EMA作为对照；再室 温避光静置5min，再置于冰上，距离650W卤钨灯15cm，持续曝光10min；

（4）PCR模板制备：取增殖培养后添加EMA曝光处理后的菌液1mL，8000r/min离心5min， 弃上清液，加0.01mL无菌蒸馏水混匀，以菌液作为PCR模板；

（5）以引物PsaF1（5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTT-3'）和PsaR2（5'–CACGCACCCTTCAATCAGGATG- 3'），以步骤（4）的菌液为模板，进行PCR扩增，目的片段长度为280bp；反应体系为25μL，其 中包括5U/μL的Taq聚合酶0.3μL，2.5mmol/L的dNTPs2μL,10×reactionBuffer2.5μL,引 物PsaF1/PsaR2（10mmol/L）各0.5μL，25mmol/LMgCl₂1.5μL,模板2.5μl，加超纯水补至25 μL；PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃15s，58℃30s，72℃30s,32个循环，最后72℃延伸 5min；琼脂糖电泳检测，出现条带表明存在活菌（+），没有出现条带则表明没有活菌（-）。